南瓜种子中黄瓜绿斑驳花叶病毒IC-RT—PCR检测方法的建立.pdfVIP

第 11卷 第 1期 漳州职业技术学院学报 VOI．11 No．1 2009年 1月 Journal of Zhangzhou Technical Institute Jan． 2009 南瓜种子中黄瓜绿斑驳花叶病毒 IC．RT—PCR检测方法的建立 黄静 ，廖富荣 ，林石明 ，陈青 (1．漳州职业技术学院食品系，福建 漳州363000；2．厦门出入境检验检疫局，福建 IXf-I3610121 摘 要：黄瓜绿斑驳花叶病毒 (Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)是葫芦科重要种传病毒之一。本文建立了免 疫捕获 RT—PCR(IC—RT—PCR)的分子检测方法直接从带毒种子中检测出该病毒，扩增获得其CP基因，并克隆到pMDI8T 载体中，经核苷酸序列分析表明，该分离物CP基因全长为486个核苷酸，编码 由161个氨基酸组成的17．3kDa蛋白，与国 内外已报道的CGMMV的CP基因相比，其核苷酸序列的同源性为91．4％～99．4％，其推导的氨基酸同源性为98．8％～100％。 IC．RT—PCR方法的建立，为检疫部门提供了从带毒种子中快速、准确检测该病毒的方法 ，很有应用前景。 关键词：南瓜种子：黄瓜绿斑驳花叶病毒；免疫捕获 RT—PCR；CP基因；序列分析 中图分类号：$436．42 文献标识码：A 文章编号：1673．1417(2009)ll1．0012-04 黄瓜绿斑驳花叶病毒 (Cucumbergreenntottlemosaicvirus，CGMMV)属番茄丛矮病毒科 (Tombusviridae)、烟草花 叶病毒属 (Tobamovirus)成员…。该病毒是葫芦科重要病毒之一，主要分布在英国、日本、印度等欧洲和亚洲的地区和国 家l2J，主要侵染包括黄瓜、西瓜、葫芦和南瓜等的葫芦科作物l。在国内是新近发现的一种葫芦科作物的种传病毒，属我国 潜在危险性有害生物 ¨l。2005年我国辽中地区发现该病毒在大 田种植的西瓜上大面积发生，给该地区的西瓜造成严重的损 失 l。近几年，厦门出入境检验检疫局曾多次从进境的南瓜种子检出该病毒，应当引起相关部门的高度重视。 国内一些植物病毒的鉴定及手段主要包括生物学检测、电镜观察、血清学技术等，这些技术存在检测周期较长、准确 性不高、灵敏度较低等方面的问题，其成功的应用，特别是口岸应用的实例极少。多年来，植物病毒的检出率极低，种传 病毒的检疫检测实例报道更为鲜见，至今为止只有极少数关于葫芦科作物种传病毒的检出报道。 随着分子生物学技术的迅猛发展，尤其是PCR技术的成熟，为病毒的检测提供了更加灵敏高效的方法。PCR技术是 一 种选择性体外扩增特异DNA片段的技术，可在短时间内获得数百万个特异性 DNA系列的拷贝lI”。免疫捕获RT—RCR (IC。RT．PCR)技术是建立在 ELISA基础上，利用抗原抗体反应和 PCR技术相结合而建立的检测技术。该技术不仅具有 免疫反应的特异性而且具有PCR的高灵敏度，特别适合于含量甚微的抗原或抗体的检测，并且操作相对简单 I。因此，建 立具有检疫重要性，种传病毒为主CGMMV的快速、准确、高灵敏度的鉴定及检疫检测方法，加强进境葫芦科种子的检验 检疫工作，对于防止该病毒的传入具有十分重要的意义。本文主要报道从截获的进境台湾进 口带毒南瓜种子中检测出黄瓜 绿斑驳花叶病毒，并建立了从带毒种子中直接检测出该病毒的IC—RT—PCR检测方法，为该病毒的检测提供了快速、准确 的检测鉴定方法。 1材料与方法 1．1 供试病毒样品 南瓜种子为厦门出入境检验检疫局2006年9月截获的台湾进 口带毒南瓜种子 (报检号为390000106044037)。 1．2 RT—PCR方法检测 1．2．1 引物设计合成 根据 GenBank中报道的黄瓜绿斑驳花叶病毒的基因序列及利用 DNAMAN分析出相应的保守区域，分别设计上游引物 和下游引物。在 GenBank登陆号 NC001801的序列中，上游引物CGMI与其 5684．5708nt相对应，下游引物 CGM2与 其 6316—6337m反向互补。 上游 引物 cGMl：5’．cGTGGTAAGCGGCATTCTAAACcTC一3’ 收稿 日期：2008—11--21 基金项 目：国家质检总局资助项 目 “葫芦科作物种传病毒检测方法的研究”(20051K00