5实验五抗血清的制备.pptVIP

第一讲 病毒与传染病基础 基本原理 将具有完全抗原性的物质注入健康的动物机体后，动物体内便会产生相应的抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需要的抗血清（免疫血清或抗体）。 一、抗原和抗体 抗原决定簇（antign determinant） 2、抗体（antibody， Ab） 二、免疫应答过程 （2）反应阶段 （3）效应阶段 三、佐剂 佐剂(Adjuvant)，又称免疫调节剂或免疫增强剂，是指先于抗原或与抗原混合后于抗原同时注入动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用，而本身并不引起机体免疫应答的一类物质。 盐类佐剂 油乳佐剂 脂质体 微生物及微生物来源佐剂 植物来源佐剂 细胞因子佐剂 1. 盐类佐剂 盐类佐剂以铝盐佐剂最常用。1926年开始应用，直至今日它仍是唯一被FDA批准使用的人用疫苗佐剂。 铝佐剂与抗原形成复合物，注射后在局部形成抗原储存库，使抗原缓慢释放，较长时间刺激免疫细胞，增强机体的体液免疫反应。 铝盐佐剂的不足之处：①只能增强体液免疫，不能增强细胞免疫。②会诱导产生IgE抗体，增加发生超敏反应的危险。③不能冻干，需在低温条件保存运输。④制备的凝胶批次之间差异很大。即难控制质量，又难对佐剂效果作出准确评价。 2. 油类佐剂 油乳佐剂中含有油和乳化剂。它的作用机制是抗原被油相形物质所包被，形成贮存库而缓慢释放，刺激免疫细胞产生抗体。油乳佐剂主要有弗氏佐剂、佐剂-65、白油Span佐剂、MF-59等。 弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂两种。FIA是由低黏度的矿物油及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂；FCA是在不完全佐剂的基础上加一定量的分枝杆菌而成。FCA是细胞免疫的强刺激剂，而FIA则仅能刺激体液免疫。 FCA和FIA主要不足之处：可引起局部肉芽肿和无菌性脓肿；使用矿物油可能有致癌问题；稳定性差，难以长期保存；有对结核菌素致敏等毒副作用，故仅限用于兽用。 3. 脂质体 脂质体是单层磷脂或由数层可溶性物质隔离开的，呈同心圆状排列的，连续多层磷脂所组成的脂质小囊，内含水相空间，能将抗原传递给合适的免疫细胞，促进抗原的定向作用。 脂质体作为佐剂存在的主要问题是稳定性：(1)所用材料的脂肪酸有不同程度的双链，贮存时会随时间而逐渐氧化，产生溶血磷脂。(2)小脂质体倾向于相互融合成大脂质体，在融合过程中可导致包入的抗原释放。 4. 微生物来源佐剂 具有佐剂活性的微生物有分枝杆菌及其成分、革兰氏阴性菌类及其产物、革兰氏阳性菌。此外，霍乱毒素(CT)、CpG DNA等也有佐剂作用。 微生物佐剂主要是细胞壁上的肽聚糖起作用，如胞壁酰二肽(MDP)、胞壁酰三肽(MTP)、蜡质D、海藻糖双霉菌酸脂(TDN)等。 其中对MDP研究较多，MDP是从分枝杆菌细胞壁上提取的一种免疫活性成分，能刺激产生IgA。MDP可刺激T细胞的增殖，还可以活化非特异性免疫，诱导机体产生细胞因子。 5. 植物来源佐剂 从南美的一种皂树中提取出来的皂素成分Quil A ，具有增强免疫反应的能力。从Quil A分离到的QS-21，可以刺激产生更多的抗原特异的抗体分泌细胞和增强细胞毒T淋巴细胞的杀伤作用。 此外，中草药如人参、当归、芦荟及复方柴术散等均有佐剂作用。 6. 细胞因子 细胞因子在免疫应答的产生和调节中具有重要作用，可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。 具有免疫佐剂效应的细胞因子主要包括淋巴因子(如IL-2)、单核细胞因子(如IL-l、肿瘤坏死因子TNF)和干扰素(包括α-和γ-干扰素)等。 细胞因子的免疫佐剂效应，主要表现为：( 1)增强机体的抗感染能力；(2)增强疫苗的保护效应。 弗氏佐剂 1.弗氏不完全佐剂 油剂：石蜡油5份 乳化剂：羊毛脂1份 2.弗氏完全佐剂 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为10～20mg/ml) 。 将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。 一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。  四、实验室小量乳化方法 1. 研磨法 将弗氏佐剂加入到研钵中，再滴加抗原，每加一滴应研磨至小滴消失，滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。 适于制备多量的佐剂抗原 缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。 2.注射器混合法 将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，以软管连接两注射器，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。 优点：无菌操作，节省抗原或佐剂 缺点：不易乳化，耗时。  3. 快速乳化法 利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。 将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉