胚胎小鼠大脑c-jun N-末端激酶表达的定量分析.pdfVIP

JournalofMathematicalMedicine Vo1．22 No．2 2009 文章编号：1004—4337(2009)02—0152—02 中图分类号：R-33 文献标识码 ：A ·基础医学研究 · 胚胎小鼠大脑 c—junN一末端激酶表达的定量分析 包翠芬# 刘 霞 魏 嘉一 梁 佳一 秦书俭 (辽宁中医药大学组胚教研室 沈阳110O32) 摘 要： 目的：探讨 unN一末端激酶 (JNK)在胚胎小鼠脑发育中的作用 。方法：按受孕时间将昆明小 鼠随机分为 6组，分别 为胚龄 10(El0)、12(E12)、14(El4)、16(E16)、18d(E18)组、新生组 (PO)，采用免疫印迹技术和光密度分析法对各组小 鼠脑 JNK进行 定量检测，以测得的JNK最大量为1(100 )，计算蛋白相对含量。结果：免疫印迹法测得ElO、El2、El4、E16、El8及PO组JNK1含 量分别为 24．57 、46．62 、62．99 、82．O6 、100 、89．65 ，JNK2／3含量分别为 58．89Voo、51．37％、28．67 、2O．33 、6．54 、 5．03 。结论：JNK在胚胎发育期间呈明显的变化规律，提示JNK可能在小 鼠大脑的发生与发育中起重要作用 。 关键词： 小 鼠； 脑 ； JNK； 免疫印迹 免疫印迹技术原理是将凝胶电泳的分辨力和免疫化学检 配制 1O 分离胶和 5 浓缩胶，取含 1Og脑组织蛋 白细 测的特异性融为一体，首先借助凝胶电泳将蛋白质抗原分离， 胞裂解上清液，加入 I％ISDS样品缓冲液，100℃加热 3min，离 然后将凝胶中的蛋 白质转印至膜上 ，使之成为被分离蛋 白的 心。取上述裂解液加入电泳胶样品槽，100V电压下 电泳，待 一 个拷贝，抗原的位置即可用特异性抗体确定 。目前免疫印 样品到达合适位置，停止 电泳，将胶板取下，转膜液洗涤 1O～ 迹技术是科研中常用的蛋白定量检测方法，该方法具有高效、 30min。将胶与 0．45~mPVDF膜 (Ig前置于甲醇 内浸透 5min 灵敏等特点。本实验应用免疫印迹法对胚胎小鼠大脑组织 c— 左右，再放人转膜液中至少 5min)置于厚滤纸 (已用转膜液浸 junN-末端激酶 (c-JunN—terminalKinase，JNK)的蛋白含量进 泡)之间，赶尽气泡，常温下半干转印，转印完成后将 PVDF膜 行检测，以探讨 JNK在胚胎小鼠脑发育过程中的作用。 用TBST(TBS--l Tueen20溶液)冲洗 ，5 脱脂奶粉溶液室 温封闭1～2h。与一抗 (兔抗小 鼠JNK抗体，稀释度为 1： 1 材料与方法 400)4~C孵育过夜，TBST洗脱 3次，每次至少5min；再与二抗 1．1 实验动物与分组 (碱性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG抗体，稀释度为 1：200)室温 取成年昆明小 鼠(辽宁医学院实验动物中心提供)，按小 孵育 lh，TBST溶液洗脱 3次 ，每次至少 5min；NBT／BCIP显 鼠孕期随机分为 El0、E12、E14、El6、El8及 P0组_1]。每组 色；扫描电泳条带，输入电脑，用光密度分析软件分析 电泳条 10只。 带光密度 。 1．2 主要试剂及仪器 1．4 统计学分析 兔抗小鼠JNK单克隆抗体 (NeoMarker公司)，细胞裂解 应用SPSS10．0软件分析，所有数据均用 ±S表示。多 液、PowerPac3000电泳仪 、Trans-blotSD半干转膜仪 (美国 组间差异显著性检验采用单因素方差分析。 Bio-Rad