适于宁夏枸杞RAPD 分析的DNA 高效提取方法.pdfVIP

· 研究简报 · 北方 园艺2009(9)：8O～82 适于宁夏构杞 RAPD分析 的 DNA 高效提取方法 贝 盏 临，任 贤，雷 茜，赵 会 伟，伏 培 云 (北方民族大学 生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021) 摘 要：采用优化的CTAB法提取枸杞叶片基 因组DNA。利用紫外分光光度计、琼脂糖凝 胶电泳检测所得DNA的浓度和纯度，并进行 了RAPD初步扩增分析。DNA浓度在 300 g／mL， 可达400．g／g(叶片鲜重)。( 。／()8。比值为 1．44～1．6(理想值为 1．8)。结果表 明：优化 CIAB法所提取枸杞总DNA的纯度高、完整、量大，能满足 RAPD扩增，条带清晰、稳定，并且提 取操作的程序快速、简便 ，试验成本低、效率高。优化 的C1 法高效提取 的枸杞基 因组 DNA不 需经氯化铯梯度离心或柱层析纯化，可以直接用于RAPD分析。 关键词：枸杞；RAPD；DNA高效提取 中图分类号 ：Q946—33 文献标识码 ：A 文章编号 ：1001--0009(2009)09一O080—03 RAPD(随机引物扩增多态性 DNA)是一种应用广 1．1 材料 泛的DNA分子标记技术，因这种技术具备成本低廉、分 宁夏枸杞叶片取 自北方民族大学实验基地 。 析速度快、无放射性污染、需要极微量的DNA以及产生 1．2 仪器与试剂 丰富的多态性等优点，而广泛应用于检测遗传多样性、 仪器：研钵、液氮罐、离心管 (50mI)、Eppendorf管 构建遗传图谱 、品种识别、种质资源的分析与收集、物种 (1．5mI、500FI、HH一4数显恒温水浴锅 (国华电器有限 起源进化以及遗传稳定性检测等方面的研究_l】]。由于 公司)、Eppendorf5415D离心机、PCR仪 (CG1—96；Gene RAPD分析要求供试 DNA完整和纯度相对较高，要用 Companylimited)、紫外分光光度计(UV754N；棱光)、电 于RAPD分析，DNA提取步骤越少越好，能减少对DNA 泳仪(DYY一12型；北京六一仪器厂)、电泳槽 (DYCp一31 的破坏；多步骤、多种试剂容易引起 DNA 的破坏和污 型；北京六一仪厂)、UvPGDS-8000凝胶成像系统、移液 染，从而影响PCR反应及PCR扩增产物的结果分析凹]。 枪 。 所以，在运用该技术进行分析时，提取完整、量大、纯度 试剂：CTAB，Taq酶 (天根生化科技有限公 司)，随 高的DNA是 RAPD分析成功的关键之一，最快、最有效 机引物 (北京奥科生物技术有限公司)，RNA酶 (华美公 提取 DNA有利于提高工作效率。 司)、液氮 。Buffer，TaqDNA聚合酶，dNTPs，1kbDNA 通常用于枸杞叶片RAPD的DNA制备的常规方 ladder购 自北京天根生化科技有限公司。 法操作繁琐，步骤多，用时较长，而且由于提取液需多次 1．3 方法 转移，易引起交叉污染和DNA丢失l2 。 1．3．1 基因组DNA的提取 (优化 (；TAB法) 取宁夏 该试验采用优化的CTAB法提取枸杞叶片全基因 枸杞干净叶片4g，置研钵 中，加液氮足量，迅速用力研 组 DNA，在试验中逐步摸索，对全基因组 DNA的提取 磨，研成极细粉末 (研磨时问 20rain以上)，移入 50mL 条件作了较大改进，所得到的DNA完整性好，电泳检测 加盖离心管中，加人 15ml预热至65℃的CTAB提取缓 精确性高，具有重复性好的迁移泳带，纯度能够满足后 冲液 (2 CTAB、20mmol／LEDTA、1．5mol／LN