蒲公英药材总DNA的提取.pdfVIP

第27卷 第6期 河 南 科 学 Vol_27 No．6 2009年 6月 HENAN SCIENCE Jun．20o9 文章编号：1004—3918(2009)06—0684—03 蒲公英药材总DNA的提取 李喜凤 -， 杜云锋 ， 张红梅 ， 郝 哲 ， 白 雁 (1．河南中医学院药学院，郑州 450008； 2．河南省医药科学研究所，郑州 450003) 摘 要：采用改良的CTAB法、SDS法、高盐低pH法提取蒲公英药材基因组总DNA，通过紫外吸收、琼脂糖凝胶电 泳检测其纯度与浓度．结果表明，改良的CTAB法所得DNA纯度最高，电泳条带最清晰、完整性好，可作为RAPD， ISSR等分子生物学研究． 关键词：蒲公英；DNA提取；SDS法；高盐低 pH法；CTAB法 中图分类号：R282．5 文献标识码：A 蒲公英为常用 中药材，系菊科植物蒲公英 (TaraxacummongolicumHand．一Mazz．)、碱地蒲公英(Taraxacum siniCUmKitag．)或同属数种植物的干燥全草，蒲公英含有大量多糖、多酚、蛋 白质等次生代谢产物，采用经典 的CTAB法所提DNA由于不可逆地结合了这些化合物而不能用于下游分子生物学研究．本试验 以蒲公英 为材料，对提取植物总DNA的几种常用方法进行了比较研究，旨在建立一种简便、快捷的提取中药蒲公英 高质量基因组总DNA的方法 ． 1 材料与方法 1．1 材料 本实验所用药材为作者采购于河南不同地区的蒲公英，经本院生药学科陈随清教授鉴定，系菊科植物 蒲公英的干燥全草． 1．2 试剂 十六烷基三 甲基溴化铵：上海山浦化工有限公司；十二烷基硫酸钠、三羟 甲基氨基 甲烷：美国Sigma公 司；EDTA：美国Amresco公司；DL15000bpDNAMarker：大连 TaKaRa公司；所用化学试剂均为分析纯． 洗涤缓冲液：250mmol／L氯化钠，250mmol／LTris—HCL(pH=8．0)，50mmol／LEDTA(pH=8．0)，5％PVP． 2xCTAB提取缓冲液：100mmo]／LTris—HCLpH=8．0，20mmol／LEDTApH=8．0，1．4mol／L氯化钠 ，2％CTAB， 5％PVP．SDS提取缓冲液：100mmol／LTris—HCLpH=8．0，100mmol／LEDTApH=8．0，250mmol／L氯化钠 ， 1％SDS，2％PVP，2％ 一巯基乙醇．高盐低pH提取缓冲液：100mmo]]L醋酸钠 ，50mmol／LEDTA，500mmol／L 氯化钠，5％PVP，3％SDS，2％ 一巯基 乙醇，pH=5．5．TE缓冲液：10mmol／LTris—HCL pH=8．0；1mmo1]L EDTA，pH=8．0． 1．3 仪器 GR22G型高速低温离心机：日本 日立公司；DYY一6C型电泳仪：北京市六～仪器厂；电泳槽：上海复 日科 技有限公司；GelDoe2000TM型凝胶 图像分析仪：德国BIO—RAD公司；微量移液器：德国eppendorf公司． 1．4 总DNA提取方法 1．4．1 改良的SDS法 参照 肖冰梅等[1的方法加以改进 ：称取 0．5g样品，加入 10％的PVP，一起在冰上用 玻璃砂在研钵中研磨；磨碎后转移至 10mL离心管中，加入 10倍体积的冰预冷的洗涤缓冲液，冰浴 10min， 10000r／min离心 5min；弃上清液，加入 1mLSDS提取缓冲液，65℃温育3h，不时振摇 ．4℃ 12000r／min 离心 10min，取上清液于另一离tS,管中，加入适量的RNaseA酶，37℃温育45min；加入等体积氯仿一异戊 醇 ((氯仿)：(异戊醇)：24：1)抽提 3次，4℃12000r／min离心 10min．取上清液分装于 1．5mLEP中，加入 收稿 日期：2009—0l一19 基金项 目：河南省重点科技攻关项 目(082102310033) 作者简介：李喜凤 (1952一)，女，河南郑州人，教授，主要从事中药新药及质量标准研究 通信作者：张红梅 (1971-)，女，河南郑州人，博士，助理研究员，主要从事分子生物学研究． 2009年6月