姜黄素诱导HO-1表达增强人脐静脉血内皮祖细胞活力及抗氧化损伤能力的实验研究.pdf

姜黄素诱导HO-1 表达增强人脐静脉血内皮祖细胞活力及抗氧化 损伤能力的实验研究 摘 要 目的：体外分离、培养及鉴定人脐静脉血内皮祖细胞（EPCs ）。探讨姜黄 素(Curcumin, CMN)诱导EPCs 表达血红素氧合酶-1 (Heme Oxygenase-1 , HO-1)增强自身细胞活力及抗氧化损伤能力的作用及机制。方法：实验研 究分为四部分：1. 人脐静脉血EPCs 的分离、培养、鉴定：采用密度梯度 离心法分离、培养人脐静脉血EPCs ，通过倒置相差显微镜下观察EPCs 形 态学变化，免疫荧光法观察EPCs 吸收Dil-ac-LDL 和FITC-UAE-1 情况并 对7d 的EPCs 进行CD133 免疫荧光鉴定。2. CMN 的细胞毒性作用及诱导 EPCs 表达HO-1 的效果评价：将培养的EPCs 分为A 、B 、C 、D 四组，分 别以终浓度为0 、5、10、15µmol/L CMN 的培养基孵育24h ，CCK-8 检测 各组细胞增殖活力、比色法检测各组培养液中 LDH 活力，分析 CMN 对 EPCs 是否具有细胞毒性作用。Western blot 检测各组细胞HO-1 表达量，明 确CMN 诱导EPCs 表达HO- 1 的作用以及选择后续实验所需CMN 的最佳 浓度。3. CMN 诱导EPCs 表达HO-1 的细胞内信号转导机制研究：将培养 的EPCs 分为A 、B 、C 三组，分别在单纯培养基、终浓度15µmol/L CMN 的培养基、终浓度 15µmol/L CMN+1µmol/L 全反式视磺酸（ATRA ）的培 养基中孵育24h 。Western blot 检测各组细胞HO-1 表达量，探讨CMN 诱 导EPCs 表达HO-1 的信号机制。4. CMN 诱导EPCs 表达HO-1 增强自身 细胞活力及抗氧化损伤能力的作用及机制研究：将培养的EPCs 分为A 、B 、 3 C、D 四组，分别在单纯培养基、终浓度 15µmol/L CMN 的培养基、终浓 度 500µmol/L H O + 15µmol/L CMN 的培养基、终浓度 500µmol/L 2 2 H O + 15µmol/L CMN+ 10µmol/L 锌原卟啉（ZnPPIX ）的培养基中孵育24h 。 2 2 CCK-8 检测各组细胞活力、比色法检测各组培养液中 LDH 活力、ELISA 法检测各组培养液中的血管内皮生长因子(VEGF)和人碱性成纤维生长因 子（bFGF ）活力、AnnexinV-FTTC/PI 双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡 率。明确CMN 增强EPCs 活力及抗氧化损伤能力的作用及机制。结果：1. 从脐静脉分离出来的单核细胞培养 3-4d 开始贴壁；7d 后有一定方向性， 呈簇状生长；大约 9d 时出现多个血岛样细胞团。表面标记 CDl33 免疫荧 光检测显示绿色阳性率90 ％，免疫荧光鉴定显示90 ％的贴壁细胞呈双荧 光染色阳性。2. 以终浓度分别为0 、5、10、15µmol/L 的CMN 孵育的各组 EPCs ，细胞增殖活力分别为（0.743 ±0.250) 、（0.810 ±0.135 ）、（0.854 ± 0.374 ）、（0.895 ±0.193 ），组间比较有显著差异（P0.05 ），表明EPCs 的增 殖活力随CMN 浓度的升高而明显升高；LDH 活力分别为（732.4 ±45.2 ）、 （728.1 ±35.8 ）、（745.7 ±48.6 ）、（750.2 ±47.3 ），组间比较无差异（P0.05 ）， 表明CMN 对EPCs 无明显毒性作用；代表HO- 1 表达量的光密度比值分别 为（0.65 ±0.02 ）、（0.87 ±0.08 ）、（1.25±0.05 ）、（1.34±0.03 ），组间比较显 著差异（P0.05 ），表明EPCs 表达HO-1 的量随CMN 浓度的升高而升高。 3. 实验3 中A 、B 、C 三组测得的代表HO- 1 表达量的光密度比值分别为 （0.47 ±0.04 ）、（1.43±0.02