酶联免疫吸附试验影响因素.ppt

温育温度的选择 1.微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中 时，孔内温度从室温升至37℃，需要 一定的时间； 2.在临床实验室中，通常是将微孔板一 放入温箱即开始计时，这样就很容易 造成实际测定中温育时间不够，弱阳 性样本测不出来的问题。 “边缘效应”的排除 1.“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深; 2.有研究证实在温育中的热力学梯度可能是 根本原因。 3.聚苯乙烯本身为不良热导体，板从室（通 常在25℃左右）置于37℃温箱，板升温 时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热 力学梯度。 总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，应尽量采用水浴。 温育中让微孔板浮于水面上（浸入1/3），或将浸透水的沙布放入一大饭盒中形成湿盒，然后放于温箱中，这样可使微孔板板孔底部直接与37℃水或湿布接触，而且水浴箱或湿盒内温度较高，可使反应溶液的温度迅速与温室平衡。 五、洗 板 血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针孔全阻塞或半阻塞，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性。 洗板的注意事项 1. 要有适当的浸泡时间（30-60秒）。 2. 洗板机吸液要彻底，残余量低于5ul。 3. 洗液应调至适当的注出量，每孔应在 350ul-450ul之间，但不要溢出孔外。 4.洗板次数应与说明书要求一致，尽量不 要私自增加或减少洗板次数。 5.稀释洗液应使用蒸馏水或去离子水，pH 值不宜过酸或过碱，保证配出的洗液pH 值为7.4±0.2，水质宜新鲜，长菌或有 沉淀不宜使用，且用非金属容器保存。 6. 由于洗涤液系高浓度磷酸盐，会形成 结晶，配制洗液时应完全溶解。 7. 稀释好的洗液4℃下可保存3—5天。 8. 洗板后，拍干包被板，应垂直扣在备好 的干净吸水纸或毛巾上，且每次拍板应 换掉前次拍过的毛巾或吸水纸，避免交 叉污染。 9. 操作洗板机过程中要不时观察洗板 机针孔内洗液的通畅状况，及时纠 正，洗板机不用时应用去离子水清 洗几遍后关机。 10.每周要进行保养清洗。 六、显 色 注意事项： 1. 检查底物溶液的有效性； 2. 试剂显色时先加A液，后加B液，二者 不要颠倒。 3. 前后加入的间隔时间不超过10分钟。 4. 若把A液和B液先混合，再加样显色， 需要求二者等体积混合。 5. A、B液应避免接触污染物。 6. 不同厂家显色液不得混用。 七、终止和读数 肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测结果，以保证结果一致性。 注意事项 1、酶标仪的波长是否合适或滤光片是否正确。 2、单波长或双波长比色选择的问题。 ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色 3、加完终止液后30分钟内读取数据。 4、保证酶标板的底部是清洁干燥的。 双波长比色？ 双波长比色测定能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响，一般不必设空白孔。 ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性； 在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。 八、结果的判读 灰区的定义 灰区又称灰色带反应。就是把OD值在Cut off值正负20%这个范围内的标本称为灰区标本。这个范围称为灰区。 灰区的处理 1.灰区是客观存在的，没有不存在灰区 的试剂，我们只是尽量减少灰区的出 现比例。 2.减少灰区最有效的方法就是尽量将板 洗涤干净。 3.严格控制温育时间。 其他的影响 1. 干扰物质的影响 常见的干扰物质如类风湿因子、 甲胎蛋白、某些自身抗体等，都会使 结果造成假阳性。 2. 药物的影响 如高效价的乙肝免疫球蛋白等。 思考题 为什么多次实验重复性差 （相同样本两次测定结果 不一致）？ 多次实验重复性差（相同样本两次测定结果不一致） A. 血清标本未完全凝固即加入； B. 不同批号试剂盒中组分混用； C. 加样； D. 温育时间、洗板、显色时间不一致； E. 孔内有污染物； F. 显色液滴加出现问题； G. 酶标仪滤光片错误,测量波长不一致. 酶联免疫吸附试验的 影响因素