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第 37卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究报告 第 11期 2009年 11月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 1606～1610 阳离子荧光共轭聚合物结合纳米颗粒用于 DNA检测 霍希琴 王胜锋 王 青 羊小海 崔 亮 (湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，化学化工学院，生物医学工程中心， 生物纳米与分子工程湖南省重点实验室，长沙410082) 摘 要 利用纳米颗粒对 目标 DNA的富集、分离作用以及阳离子荧光共轭聚合物 良好的荧光特性，建立了一 种特异性检测DNA的新方法。首先将标记有猝灭基团的DNA捕获探针修饰到纳米颗粒上，捕获互补的DNA 分子；然后加入 sl核酸酶 ，除去未捕获到互补DNA的捕获探针；最后用 DNaseI将颗粒上的双链切断，使猝 灭基团从纳米颗粒上解离下来，与阳离子荧光共轭聚合物结合并猝灭其荧光。结果表明，目标核酸的浓度与 该聚合物的荧光猝灭程度正相关，且具有 良好 的特异性，线性响应 范围为 5．0～40nmo~L；检出限为 3．7nmo~L(S／N=3)。 关键词 阳离子共轭聚合物，纳米颗粒，脱氧核糖核酸，核酸酶 1 引 言 DNA分子的识别和检测在生物学基础研究、临床检验、法学鉴定、药物开发以及环境保护等领域起 着重要作用 ¨。现已发展了DNA分子杂交 (DNA印迹)、限制性内切酶酶谱分析、聚合酶链反应 (PCR)、化学和生物传感以及生物芯片等多种技术进行DNA分析。随着相关研究的不断深入，对 DNA 检测方法的灵敏度和特异性提出了更高的要求 。 纳米颗粒作为一种新型的固相载体材料，具有尺寸小、比表面积大的特点，是分离和富集痕量 DNA 或 RNA的优秀工具 。金纳米颗粒除具有以上纳米颗粒的优点外，还具备制备方法简单、表面易于 修饰、重现性好且稳定等优势 ，因此得到了广泛应用。 荧光共轭聚合物作为一种新型的荧光分子，具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点 10,11]。 同时，共轭聚合物具有 “分子导线”的功能，能够实现荧光信号的放大_l。基于这些独特的荧光性质，荧光 共轭聚合物已被广泛用于核酸 H]、蛋白质 ¨等生物大分子以及ATP[]、葡萄糖 ”等小分子的检测。 本研究利用阳离子荧光共轭聚合物(Cationicconjugatedpolymer，CCP)的荧光特性和金纳米颗粒对 核酸分子的分离、富集功能，结合 s1核酸酶对错配位点的剪切能力，发展了一种高特异性的核酸定量检 测新方法 。 2 实验部分 2．1 仪器与试剂 六通道DNA合成仪 (德国Polygen公司)；1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；F-2500荧光 分光光度计(日本Hitachi公司)；DU800紫外可见分光光度计、高速离心机 (美 国BeckmanCoulter公 司)；超纯水系统(美国Millipore公司)。 阳离子荧光共轭聚合物 CCP参考文献[18～20]合成，结构如图1a所示；金纳米颗粒采用柠檬酸三 钠还原法制备l2。。，粒径约为13nm；巯基DNA捕获探针由大连宝生物公司(Takara)合成，其3端标记猝 灭基团4一(4．二甲基对氨基偶氮苯基)苯 甲酸 (DABCYL)，3条普通DNA序列为实验室 自行合成，序列 根据p53基因175密码子设计(见表 1)；Sl核酸酶和DNaseI酶(大连宝生物公司)；氯金酸、柠檬酸三 钠(中国国药集团化学试剂有限公司)；其它试剂均为分析纯。实验用水均为过滤除菌的高纯水。实验 器皿均经过高温灭菌处理。 2009-01-31收稿 ；2009-04-25接受 本文系国家 自然科学基金(N0、863计划(No．2007AA022007)、湖南省科技计划项 目(No．2008FJ3205)和湖南省杰出青年 科学基金(No．08JJl902)资助项 目 E—mail：yangxiaohai@hnu． 第 11期 霍希琴等 ：阳离子荧光共轭聚合物结合纳米颗粒用于DNA检测 1607 表 1 核酸序列 Table1 S