PCR扩增检测转基因大豆、玉米.pdf

PCR扩增检测转基因大豆、玉米 PCR扩增检测转基因大豆、玉米 【实验目的】 【实验目的】 通过PCR扩增方法检测市场常见大豆、玉米 通过PCR扩增方法检测市场常见大豆、玉米 产品是否含有转基因成分 产品是否含有转基因成分 培养学生的实验设计能力和创新能力 培养学生的实验设计能力和创新能力 【实验原理】 【实验原理】 以大豆特异性内源基因大豆凝集素(Lectin) 以大豆特异性内源基因大豆凝集素(Lectin) 基因或者玉米特异性内源基因IVR为内参， 基因或者玉米特异性内源基因IVR为内参， 花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S启动 花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S启动 子) 、农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止 子) 、农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止 子)及外源基因5-烯醇丙酮-莽草酸-3-磷酸合酶 子)及外源基因5-烯醇丙酮-莽草酸-3-磷酸合酶 (CP4-EPSPS)基因为靶基因检测大豆和玉米中 (CP4-EPSPS)基因为靶基因检测大豆和玉米中 的转基因成分。 的转基因成分。 【实验步骤】 【实验步骤】 大豆、玉米DNA 提取--改良的CTAB法 大豆、玉米DNA 提取--改良的CTAB法 称取0.1g样品，在研钵中充分研磨。加入1000 μL CTAB提取 称取0.1g样品，在研钵中充分研磨。加入1000 μL CTAB提取 液，继续研磨充分后加入到1.5mL Ep 管中；向EP 管加入4 μL 液，继续研磨充分后加入到1.5mL Ep 管中；向EP 管加入4 μL RNaseA ，至于65℃水浴，过程中混匀3~5 次，30min ， RNaseA ，至于65℃水浴，过程中混匀3~5 次，30min ， 12000r/min室温离心10min；取上清于新的Ep管中，加入等体积 12000r/min室温离心10min；取上清于新的Ep管中，加入等体积 氯仿：异戊醇(24: 1) ，轻缓颠倒数次(或至于漩涡震荡器上混 氯仿：异戊醇(24: 1) ，轻缓颠倒数次(或至于漩涡震荡器上混 匀) ，室温静置5min，室温12000r/min离心10min；重复加入氯仿 匀) ，室温静置5min，室温12000r/min离心10min；重复加入氯仿 异戊醇一到两次 (过程中如上清液量太少，可适量加入三重蒸馏 异戊醇一到两次 (过程中如上清液量太少，可适量加入三重蒸馏 水) ；取上清于新的Ep管(千万不要吸入下层液体) ，再加入等体 水) ；取上清于新的Ep管(千万不要吸入下层液体) ，再加入等体 积的CTAB沉淀液，轻缓颠倒混匀后室温静置1h，15000 r/min室 积的CTAB沉淀液，轻缓颠倒混匀后室温静置1h，15000 r/min室 温离心10min；弃上清液，加入400 μL 1.2mol/L 氯化钠溶解沉 温离心10min；弃上清液，加入400 μL 1.2mol/L 氯化钠溶解沉 淀，56℃温浴15min，期间轻摇EP 管数次助溶；加入800 μL - 淀，56℃温浴15min，期间轻摇EP 管数次助溶；加入800 μL - 20 ℃无水乙醇，-20 ℃静置1h，15000 r/min室温离心10min；弃上 20 ℃无水乙醇，-20 ℃静置1h，15000 r/min室温离心10min；弃上 清液，用75% 乙醇洗涤沉淀两三次后，在室温下自然风干用三重 清液，用75% 乙醇洗涤沉淀两三次后，在室温下自然风干用三重 蒸馏水溶解储存于4 ℃。 蒸馏水