利用Cre—loxP自动去除禽痘病毒重组体的报告基因.pdfVIP

弘简 字 UlU．j 利用 Cre—loxP 自动 去 除禽痘 病毒 重组 体 的报 告基 因 夏薛梅 ．杨胜富 ，于可响 ，王莉莉 ，高月花 ，黄兵 ， (1．贵州凯里学院环境与生命科学学院，凯里 55601l；2．贵州省余庆县构皮滩镇畜牧兽医站 ； 3．山东省农业科学院家禽研究所，济南 250023) 摘要：在含痘病毒早晚期启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒侧翼各引入 1个loxP序列。 以禽痘病毒 282E4株作为候选载体，通过同源重组将其插入到病毒基 因组的FPV030区域 ，获得 了 表达 GFP的重组禽痘病毒。然后在 Cre酶介导下，利用loxP位点特异性重组剪除了重组病毒基因 组 中的GFP报告基 因。结果表明，以GFP作为筛选标记使重组病毒的构建更为简便 ，同时利用 Cre—loxP系统可以轻松地去除报告基因 这种技术有利于其它抗原性基因重组禽痘病毒的构建。 关键词 ：禽痘病毒 ；绿色荧光蛋 白；Cre—loxP；位点特异性重组 中图分类号：$852．659．1 文献标识码：B 文章编号：1673—1085(2olo)o3—0012—04 禽痘病毒属于痘病毒科禽痘病毒属的成员，其 除重组体基因组中的GFP报告基因，大大简化了 宿主范围较窄，仅感染禽类，在哺乳动物体内呈流产 目的基因重组禽痘病毒的构建过程，为禽痘病毒基 性感染，但不影响外源基因表达。所以它不仅可以用 因工程载体的研究提供了新的思路。 来研制禽流感病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、 l 材料与方法 传染性法氏囊病毒等的基因工程活载体疫苗p删，而 1．1 病毒与细胞 禽痘病毒 (Fowlpoxvirus，FPV) 且可以作为非复制型病毒载体开发哺乳动物基因 282E4株，商品化疫苗毒株，本室保存。鸡胚成纤维 工程活载体药物，用于禽类 以外的动物乃至人类疾 细胞 (CEF)，按常规制备。 病的预防或治疗。过去在禽痘病毒基因操作和重组 1．2 质粒与菌种 PMD18一Tvector购 自宝生物工 体的纯化过程 中。常常使用新霉素抗性 、f∞z等筛 程(大连)有限公司。质粒pEFGPTI2s(含痘病毒的早 选标记 ，这些报告基因与 目的基因以嵌合方式存在 晚期复合启动子)、pXO1(含两个串连的loxP序 于构建好的重组病毒基因组中 增加 了外源基因的 列)、pX02(将 pEGFP—C1用BglII／BamHI双切去除 长度，有可能影响到重组病毒的遗传稳定性 ，同时 多克隆位点连接而得)、pCre(编码Cre重组酶基因 重组病毒的应用亦受到一定限制。因此．将重组体 表达盒)为本室保存。 中的报告基因去除是非常重要的内容。Cre重组酶 1．3 工具 酶 与试 剂 限制性 内切 酶 ．T4 DNA 由Stenibergt】发现于P1噬菌体，它能识别 34bp部 Polyermase．T4DNA Ligase，牛小肠碱性磷酸酶 分回文的loxP序列，这种通过分子问重组的方式 (CLAP)，dNTP，rTaqDNA聚合酶为宝生物 (大连)公 很容易将两个同向loxP序列间的核苷酸序列有效 司产 品 。LipofectamineTM 2000脂 质体 购 自 切除[21。绿色荧光蛋 白(GFP)标记筛选简便，已广泛 [nvitrogen公司。 用于基因工程操作 ，由于禽痘病毒有其 自身启动子 l4 重组臂的扩增、克隆、测序 按常规方法提取 复制转录的特殊性，含 CMV、SV40启动子的GFP 282E4株 病毒 细胞 毒 DNA。根据FPV(GenBank 筛选标记很少用于禽痘病毒的基因修饰。本次试验 AF98100)设 计 引 物 ，正 链 引 物 为 5 一 构建了以含痘病毒早晚