Ad-p53逆转乳腺癌细胞株多药耐药性及其对P—gP、TOPOⅡ和GST-π表达的影响.pdfVIP

维普资讯 维普资讯 常志坤，等 ．Ad一053逆转乳腺癌细胞株多药耐药性及其对P-gp、TOPO11和GST一1r表达的影响 gendicine)购 自深圳赛百诺公司；多柔比星购 自意大 以8O g／孔在8％SDS分离胶 中电泳(120V，1．5h) 利法玛西亚普强公司；RPMI．1640、小牛血清购 自 后，转移至PVDF膜(100V，1h，45min)，鼠抗P．gP Gibco公司；cck-8试剂盒为 日本株式会社同仁化学 单克隆抗体 (1：100)、鼠抗 TOPOII单克隆抗体 研究所产品；鼠抗 P-gP(C219)单克隆抗体购 自A． (1：1000)4oC温育过夜，辣根酶标记山羊抗小鼠 1exis公司；兔抗 GST-订单克隆抗体购 自德国Merck IgG(1：10000)37oC温育 1h，以B-actin(1：1000) 公司；鼠抗TOPOII单克隆抗体购 自Topogen公司； 作为内参对照，ECL显色，胶片曝光；以8O g／孔在 辣根酶标记山羊抗小 鼠IgG、碱性磷酸酶标记山羊 10％SDS分离胶 中电泳 (120V，1．5h)后，转移至 抗兔 IgG购 自美 国Jackson公司；B．actin(C4)为 PVDF膜(100V，1h，45min)，兔抗GST．订单克隆抗 SantaCruz公司产品o 体 (1：1000)室温温育2h，碱性磷酸酶标记山羊抗 1．2 腺病毒滴度测定 Ad．p53剂量为 1×10 VP／ 兔 IgG(1：10000)37oC温育 1h，按BCIP／NBT试剂 支(VP：病毒颗粒，virusparticle)，空斑实验确定其 盒说明显色，并以B．actin(1：1000)作为内参对照， 滴度为 1×10mpfu／支 (PFU：空斑形成单位，plaque ECL显色，胶片曝光。 formingunit)。 1．6 统计分析 用 SPSS11．5统计软件分析数据， 1．3 细胞培养 MCF．7细胞常规培养于含 10％小 结果用均数 ±标准差表示 。用 t检验 ，各组数据 比 牛血清、100U／ml青霉素、100U／ml链霉素的RP． 较采用方差分析，P0．05为差异有显著性。 MI-1460培养基中，在37℃，体积分数为5％的CO2 2 结 果 饱和湿度培养箱中进行培养。MCF．7／Adr细胞除上 述培养条件外以 1．0 g／ml的多柔比星维持培养， 2．1 Ad·p53对MCF-7／Adr细胞耐药性的逆转作 以维持细胞的耐药性。细胞为贴壁生长，0．25％的 用 MCF-7／Adr和MCF-7对多柔 比星的IC。分别为 胰蛋 白酶消化传代，1～2d换液一次。取对数生长 (4．54±0．91)xIg／ml和 (0．04±0．01)xIg／ml，即 期细胞进行实验。 McF．7／Adr对多柔 比星的耐药性是敏感株 MCF．7 1．4 细胞药敏实验 实验前两周将 MCF-7／Adr细 的 118．1倍(P0．001)，50MOIAd．p53感染MCF- 胞置于无多柔 比星的培养基 中培养，取对数生长期 7／Adr细胞48h后使多柔 比星 Ic。降到 (0．26± 的MCF-7及 MCF-7／Adr细胞，按 1×10／孔接种于 0．11)xIg／ml，逆转耐药倍数为 18．1倍 (P 96孔培养板，以无血清、无双抗 RPMI．1460培养基 0．001)。 培养24h后，设空 白调零组 (不接种细胞)、MCF-7 2．2 Adp·53对 P·gP、TOPOII和 GST·蛋 白表达