一株内生细菌EA的分离鉴定及其对小麦白粉病菌的抑制效果.docVIP

一株内生细菌EA19的分离鉴定及其对小麦白粉病菌的抑制效果 摘要：从药用植物一年蓬茎组织中分离并筛选获得了1株内生生防细菌ea19。经形态学、生理生化和16 s rrna编码基因序列分析等实验，ea19与解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）亲缘关系最近。采用菌丝生长速率法对ea19进行了10种植物病原真菌的抑菌活性测定。结果表明，ea19菌体对稻梨孢、镰孢菌、胶孢炭疽菌、稻平脐蠕孢、立枯丝核菌、核盘菌、链格孢和青霉菌等植物病原真菌具有拮抗活性，对稻梨孢和核盘菌的抑制率分别达到96.99%±1.10%和99.16%±0.65%。ea19菌体对小麦白粉病菌（blumeria graminis f. sp. tritici）的分生孢子萌发和吸器形成具有极显著的抑制作用（p目前应用生防细菌来防治小麦白粉病已有很多报道。范瑛阁等[3]从土样中分离并筛选获得的3株细菌对小麦白粉病具有60%以上的防治效果，且具有增产作用。王美玲等[4]对白粉病生防细菌pe4进行发酵条件的探索。枯草芽孢杆菌a2发酵液防治小麦白粉病的最好效果可达72.22%[5]。植物内生细菌是防治植物病害的重要生防菌资源之一。它们不仅能与植物互惠共生，而且很多成员具有优良的抑菌活性。本研究旨在从植物组织中分离具有拮抗活性的内生细菌，为防治小麦白粉病等重要植物病害提供生防菌材料，并为进一步开发环境友好型生物农药奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 药用植物一年蓬[erigeron annuus（l.）pers]从中国科学院武汉植物园药用植物园采集获得。 培养基：psa固体培养基；na培养基；lb培养基。 供试菌株：禾布氏白粉菌小麦专化型（blumeria graminis f. sp. tritici）、稻梨孢（magnaporthe grisea）、镰孢菌（fusarium graminearum）、胶孢炭疽菌（colletotrichum capsici）、稻平脐蠕孢（bipolaris oryzae breda de haam）、大丽轮枝孢（verticillium albo-atrum reinke et berthold）、立枯丝核菌（rhizoctonia solani kühn）、核盘菌[sclerotinia sclerotiorum （lib.） de bary]、链格孢[altermaria altemata （fries）keissler]、齐整小核菌（sclerotium rolfsii sacc）和青霉菌[penicillium expansum（link）thom] 均由本实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 细菌菌株的分离 将健康新鲜一年蓬的根、茎和叶分别用自来水冲洗干净，切成1 cm2左右的小块，在有效氯为5%的次氯酸钠溶液中浸泡5 min， 再在70%的乙醇中浸泡30 s，无菌水漂洗4次，加1 ml无菌水细细研磨，将汁液稀释至104、105和106倍，取200 μl涂布在na平板上。30 ℃培养48 h，挑取单菌落多次划线分离纯化，于-70 ℃保存在50%的甘油中。同时将表面消毒过但未研磨的根、茎、叶组织块放置在na平板上作为阴性对照。 1.2.2 内生细菌的拮抗活性测定 1）对兼性腐生真菌的拮抗活性测定。从保存的菌种刮取少量菌液在na平板上划线，取单菌落在2 ml lb培养基中30 ℃，180 r/min摇培过夜，反复3次。以1∶100的比例吸取菌液在100 ml lb培养基中摇培18 h，取20 μl菌液均匀涂布在固体na平板圆周外围，30 ℃培养24 h制成拮抗平板，并以涂布lb培养基的平板为空白对照。将10种靶标菌（小麦白粉病菌除外）的新鲜菌饼（直径为5 mm）放置在拮抗平板中央，28 ℃培养，直至对照平板菌落即将长满全皿时，按下列公式计算抑制率：抑制率=（a-b）/（a-5）×100%，其中a、b分别表示对照菌落生长直径和拮抗平板菌落生长直径。 2）对专性寄生菌白粉病菌的生物活性测定及组织学观察。ea19菌体的制备与兼营腐生菌的拮抗活性测定相同，组织学观察参照yang等[6]2008年报道的方法进行。 1.2.3 ea19的分类鉴定 1）形态学和生理生化鉴定。形态学观察和革兰氏染色参照周德庆[7]的方法进行。生理生化鉴定采用法国梅里埃公司vitekk 2细菌鉴定仪（ver：03.01）进行。 2）16 s rrna编码基因序列鉴定。采用ctab法[8]提取基因组dna，作为pcr反应的模板dna。以16 s rrna编码基因通用引物[9]27bf （5′-agagt ttgatcctggctcag-3′）和1492br（5′- ggttacc ttgttacgactt-3′）进行