第九章DNA序列分析.pdfVIP

9章 DNA序列分析 o Maxam Gilbert化学降解法 o Sanger双脱氧链终止法 o DNA片段序列测定的策略 o 核苷酸序列的生物信息分析 9.1 Maxam Gilbert化学降解法 9.1.1 基本原理 o 1977年，A．M．Maxam和W．Gilbert首先建立了DNA片段 序列的测定方法 o 原理：将待测DNA片段的5 端磷酸基团作放射性标记， 再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并 在该位置打断核酸链，从而产生一系列长度不一且分别 以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片 段群通过并列点样 （lane-by-lane）的方式用凝胶电泳 进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基 序列。 o 核 原理:特定化学试剂可对不同碱基进行特异性修饰 并在被修饰的碱基处 （5 ′或3 ′）打断磷酸二酯键，从 而达到识别不同碱基种类的目的。 1 9.1.2 化学降解测序法的基本步骤 o 化学降解测序法的基本步骤包括： （1）对待测DNA片段的5 ′端磷酸基团作放射性标记； （2）用化学修饰剂修饰特定碱基； （3）凝胶电泳分离和放射自显影显示出各片段的长度 （4）读序，由于在同一反应体系中，各DNA片段的标 记端相同、起始位点相同，所以，根据断裂部位至 标记端起始部位之间的距离 （片段长度），即可得 出碱基顺序。 9.1.3 化学修饰试剂 碱基体系 化学修饰试剂 化学反应 断裂部位 G 硫酸二甲酯 甲基化 G A+G 哌啶甲酸 脱嘌呤 G和A C+T 肼 打开嘧啶环 C和T C 肼+NaCl 打开胞嘧啶环 C AC 90℃， 断裂反应 A和C NaOH(1.2mol/L） 哌啶（90℃，1mol/L）在修饰位点两端使DNA的糖-磷酸链断裂 2 图9-1 Maxam- Gilbert化学降 解法测序原理 9.1.4 化学降解测序法的应用 o Maxam-Gilbert化学降解测序法不需要进行酶催 化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来 的误差； o 对未经克隆的DNA片段可以直接测序。 o 化学降解测序法特别适用于测定含有如5-甲基 腺嘌呤、G ＋C含量较高的DNA片段以及短链的寡 核苷酸片段的序列。 o 测定长度大约250个碱基 3 9.2 Sanger双脱氧链终止法 9.2.1 基本原理 p1977 英国的F．Sanger设计的方法 o双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3 位置的- OH缺失，致使下位核苷酸的5磷酸基团 法与之结合。一旦双脱氧核苷酸整合到正 在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此 终止。 图9-2 双脱氧 核苷酸 （ddNTP）分 子结构及DNA 链合成终止反 应 o A．正常 的DNA合 成反应； o B．ddNTP 掺入到 DNA合成 反应后导 致反应终 止 4