肝脏疾病的超声诊断分析.pdfVIP

· 310 ·中国伤残医学2014年22卷第2期ChineseJournalofTraumaandDisabilityMedicine，2014，Vo1．22，No．2 硫酸铵沉淀免疫血清 ，DEAE柱层析纯化提取 IgG(5mg／ 为25．6％；76．9％；84．4％。特异性各为 100％(其它种念珠菌感 ml1，一40℃待用。酶结合物辣根过氧化物酶标记兔抗 白念IgG 染中均为阴性)。此外与甘露聚糖抗原及B一葡聚糖抗原联合 抗体的制备 ：以过氧化物酶2．5rag~j[L．pH5．6的醋酸盐缓冲液 应用的阳性更可达76．9％、87．5％及84．4％、87．5％的特异性与 (1mol／L醋酸11．2ml；lmol／LNaOHlOml混合后加水至50rn1)及 敏感性。 0．06mol／L的过碘酸钠0．25ml，置4℃30分钟后加入乙二醇氯 1-3基因检测法：分离念珠菌壁羊毛固醇C14一去甲基酶 化钠0．25ml，室温置30分钟 ，再加入冷无水乙醇3ml，1500g离 的特异基因片段经基因探针 ，PCR测定可作为诊断念珠菌病 心10分钟，取沉淀，以80％冷乙醇洗后离心10分钟 ，取沉淀使 的敏感方法。 再溶于1．25ml水中，加入兔抗 白念珠菌IgG抗体(5rag／1．25m1)， 2念珠菌特异抗体的检测：念珠菌为健康人群的常驻真 以pH9．6碳酸缓冲液至pH9．0，4℃过夜 ，翌 日加硼氢化钾 菌，故在健康人群中可测到相应的微量凝集及补体结合抗体， (10mg／m1)25td，室温2小时，NaHPO调节至pH达中性 ，等量甘 在深部念珠菌病 中，以乳胶凝集，免疫扩散，对流免疫等方法 油混匀使成5o％(vv／)的PBS溶液，一40 保存待用，临用前以 可以检出抗念珠菌的沉淀抗体，动态测定还可决定预后及获 1：5000(50ml加50mlPBS)稀释后待用。纯化甘露聚糖抗原的 得方法的特异性 ，但患者中多数有免疫低下致出现假 阴性或 制备 ：于白念珠菌冻干粉中加入含45％的苯酚的1／15mol／LPBS 低滴度等使方法有一定限制。 (pH7．21，边加边研磨使成乳液状，于高速匀浆器中摇动15分 2．1免疫双扩散试验 ：系利用特异抗体可与相应抗原结合 钟，室温下对蒸馏水透析过夜以除去苯酚，9000g离心30分钟， 沉淀的原理，以固相琼脂为载体，使抗原抗反应于琼脂中形成 以无水乙醇洗尽沉淀中的苯酚 ，再加入少许水于 100％抽提 1 肉眼可见的沉淀带即为阳性。试剂制备方法 ：白念珠菌细胞 小时 ，300％离心30分钟 ，沉淀物再加入 1O倍体积的3％ 抗原的制备。于37 48小时生长于葡萄糖蛋白胨酵母肉汤 NaOH，100％水浴抽提6小时，3000g离心15分钟 ，取上清，HC1 培养基中生长的白念珠菌 ，以Tris缓冲液盐水冲洗3次，再以 中和后，对蒸馏水透析以去盐，减压法浓缩至少量体积，再溶 1：4的念珠菌孢子悬液超声振荡3分钟，置3000g离心30分 于元水乙醇使终浓度达80％，一20％过夜 ，3000g离心15分钟 ， 钟，取上清 ，浓缩至蛋白含量达 lOmg／ml，加柳硫汞配成0．01％ 沉淀物 以丙 酮干燥 即为甘露聚糖 的粗制 品，如再于 浓度于冰箱中备用。操作方法：抗原抗体合适比例的选择 ：以 DEAE—SephadexA50层析，以去离子重蒸馏水透析、冷冻干燥 制备的白念珠菌抗原作倍 比稀释后，与各相应的抗白念珠菌 后即可纯化，与兔抗 白念珠菌抗血清作双扩散及免疫电泳测 抗血清反应 ，取反应中出现A、B、c3条沉淀带的抗原抗体比例 定证实为单条清晰的沉淀线即可证实为纯制品的甘露聚糖 的样品即为最佳的抗原抗体比。 抗原。 2．2乳胶凝集试验：试剂与方法：同前所述，待检血清应先 1．2免疫 印迹法 ：可检测念珠菌烯醇酶(48kDa)、敏感性 天56℃，3O分钟灭活 ，检测同时应设++以上标本的阳性孔及 71．8％，特异性 100％。(1)先将 白念珠菌细胞浆提取物经电泳 阴性对照孔 ，阳性时可作倍比稀释以确定阳性滴度，为获1：8 分离出48KDa及92kDa2条 电泳沉积带，提出后免疫家兔 按 以上阳性即可诊断为系统性念珠菌病 ，动态检测 由阴性转为 常规以硫酸铵分层法提纯血清而获得抗烯醇酶抗体。f2)待检 阳性达4倍以上滴度时即可确为本病 ，如阳性滴度为 1：