携带神经营养因子-3基因的重组腺病毒的构建和鉴定.pdfVIP

10 JBengbuMedColl，January2010，Vo1．35，No．1 [文章编号]1000-2200(2010)01-0010-04 · 基础 医学 · 携带神经营养因子．3基因的重组腺病毒的构建和鉴定 范 迟 ，高 下 ，徐 琳 ，朱光洁 ，陈 杰 ，麻晓峰 ，丁小琼 ，陆 玲 ，周 函 [摘要]目的：构建含人神经营养因子一3(neurotrophin一3，NT一3)的重组腺病毒载体，为初步研究NT一3的在体功能做准备。方法： 酶切法从已构建好的真核表达载体NT一3一pIRES2一DsRed2质粒中切下含有 NT一3和DsRed2(包括连接区域plRES2)的目的片 段，将其插入到腺病毒骨架质粒pAdShuttle—CMV的多克隆位点中，电穿孔法将腺病毒骨架载体pAdShuttle—CMVN·T-3-DsRed2 和预转入人肠杆菌BJ5183的穿梭载体pAdEasy一1进行细菌内同源重组。PacI酶切线性化鉴定正确的同源重组载体，脂质体 法转染293T细胞，包装形成表达NT一3目的蛋白和红色荧光的腺病毒。通过293T细胞3轮扩增病毒，氯化铯密度梯度离心， 获得高滴度的纯化腺病毒。Westernblot方法检测蛋白表达情况。结果：同源重组质粒载体的DNA测序证实腺病毒载体中含 有NT．3的目的片段，Westernblot证实感染重组腺病毒的293T细胞中有相应的NT·3蛋白表达；病毒滴度为 10PFU／ml。结 论：利用细菌内同源重组的方法可以成功构建同时表达NT一3蛋 白和红色荧光的重组腺病毒。 [关键词】腺病毒，人；人神经营养素一3；红色荧光蛋白；耳蜗圆窗 [中国图书资料分类法分类号]R373．1 [文献标识码]A ConstructionandidentificationofrecombinantadenoviruswithNT-3gene FAN Chi一，GAO XiaIXULin，ZHUGuang-jie，CHENJie，MAXiao—feng，DINGXiao—qiong，LULing，ZHOUMan。 , (1．MedicalCollege，SoutheastUniversity，NanfingJiangsu210009；2．DepartmentofOtorhinolaryngology， TheAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool，NanjingJiangsu210008，China) [Abstract]0bjective：Toconstructtherecombinantadenovirusvectorcarryingneurotrophin一3(NT一3)gene．Methods：NT一3and DsRed2(includingtheligationregionplRES2)fragmentwhichhadbeendigestedbyproperenzymefrom NT一3一pIRES2：DsRed2 plasmidwereclonedintoadenoviruspAdShuttle—CMV plasmid．AdenovirusvectorpAdShuttle—CMV—NT3·-DsRed2wereelectroporated intoBJ5183whichhadbeentransformedintopAdEasy—lpreviouslytohavetherecombinationwith pAdEasy一1．RecombinantAdEasy plasmidDNA wasanalyzedand linearizedbyPacI．then transfeetedinto293A cellswith liposomemethod．Theadenovirusthat expressedNT一3ptoteinandredfluorescencewassuccessfullyconstructed．Theadenoviruswasamplifiedin293A cellsthreetimes。and highqualityadenoviruswasobtai