女性生殖道新抗菌肽纯化及鉴定.pdfVIP

女性生殖道新抗菌肽的纯化及鉴定 研究生：王莉莉 导师：黄宁教授 中文摘要 【背景】抗菌肽是天然免疫的重要介质，由机体自身基因编码产生， 具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等生物学活性。女性生殖系统也是天然免疫 的重要场所，迄今在女性生殖道中已鉴定出有多种抗菌肽或抗菌蛋白分子 存在，例如防御素、溶菌酶、乳铁蛋白、白细胞蛋白酶抑制剂等。是否还 存在新的抗菌蛋白或肽分子，目前仍然受到学者们的关注。现今已鉴定出 的女性生殖道抗菌肽或抗菌蛋自来源于上皮细胞和／或白细胞，这些天然 抗菌分子是否有新的细胞来源，也是令人感兴趣的问题。因此本研究对人 子宫内膜粘液和子宫颈粘液的酸溶性提取物进行分离纯化，力图鉴定出新 的抗菌肽分子，并对所鉴定出的抗菌肽分子的细胞来源、组织学分布也进 行了分析。此外，抗菌肽分子具有圃有或诱导表达的特点，因此我们对新 鉴定出的分子在临床炎症和非炎症状态下的表达情况进行了分析，以期进 一步了解女性生殖道的天然免疫机制，并为其将来用于临床女性生殖道感 染防治打下基础。 【方法与结果】对收集的子宫内膜粘液和子宫颈粘液酸溶性提取物 分别进行制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(AU．PAGE)，并用电泳琼 l 女性生殖道新抗菌肽的纯化及鉴定一中文摘要 脂糖弥散法检测其抗菌条带，切下相应的抗菌条带进行洗脱电泳。洗脱物 透析冻干后，重溶于O．01％乙酸，予．20(2保存备用。 冻存的子宫内膜洗脱样品经反相高效液相色谱(HPLC)分离，在第 39分钟保留时间纯化出一个分子，命名为HUP．39。Edman降解法测定其 N端前10个氨基酸序列为FLSFPTTKTY，经GenBankBLAST程序检索， 未检索出与其它的任何蛋白分子同源；质谱仪检测其分子量为 为hHEM．a 软件对该片段氨基酸残基组成、等电点及结构域分析表明：该片段富含碱 性氨基酸，其等电点为8．38，包含3个完整的Q螺旋跨膜结构域。琼脂 糖弥散法检测显示HUP．39对大肠杆菌安苄青霉素耐药株ML．35p、大肠 冻存子宫颈粘液洗脱样品通过HPLC分离，在第21分钟出峰时间(保 留时间)纯化出一个分子，命名为HCP-21。该分子对大肠杆菌安苄青霉 素耐药株ML一35p有较强的抑菌活性。经N端氨基酸序列分析并通过 BLAST检索发现，HCP-21 N-端前lO个氨基酸与HMGN2N．端第2～11 确定该分子为HMGN2。提取原代培养富颈上皮细胞的总RNA，以 HMGN2 基因片段，与HMGN2 eDNA大小相同。表明在生理状况下，富颈上皮细 胞即可表达其mRNA。用亲和纯化的重组HMGN2质粒表达的融合蛋白 女性生殖道新抗菌肽的纯化及鉴定一中文摘要 生理状态下宫颈组织切片和宫颈粘液涂片进行HMGN2分子免疫组化分 析表明，该分子存在于子宫颈粘液，并主要分布于子宫颈粘膜层。免疫打 点杂交显示HMGN2炎症组与非炎症组标本HMGN2含量无统计意义差 异，表明该分子无诱导表达特性。 【结论】HUP-39是人血红蛋白a链片段，具有抗革兰氏阴性菌作 用。我们认为子宫内膜粘液中的抗菌分子不仅来源于上皮细胞和白细胞， 也可来源于红细胞。HCP-21是HMGN2分子，我们首次在子宫颈粘液中 鉴定出该分子，且该分子在宫颈粘膜上皮组织固有表达。因此它也是子宫 颈粘液天然免疫防御分子的重要成员之一。 【关键词】女性生殖道；子宫内膜；子宫颈；抗菌肽：hHEM咄HMGN2 塞堂皇塾塑堑塑萎萱墼丝垡墨鳖塞二壅皇塑墨——————————一 ofNovel andCharacterization Identification Duct FemaleProductive