重组牛朊病毒和人粒细胞集落刺激因子的色谱复性并同时纯化.pdf

摘要 基因重组蛋白的复性是生物工程下游技术中的一个关键问题，因长期末能得 到很好的解决，从而在很大程度上制约着生物]：程产品的产业化。用液相色谱(LC) 进行变性蛋白复性是近年来迅速发展起来的一种新的方法，它能够显著地提高蛋 白复性效率，并同时使目标蛋白得到纯化，目前已成为固际上的研究热点。本论 并同时纯化工艺进行了放大。 论文包括以下八个部分： 1．文献综述：简要地介绍了蛋白质复性的意义，对近年来发展起来的蛋白质复 性新方法进行了系统的综述。也对朊病毒和rhG—CSF的复性及分离纯化研究 进展进行了评述。引用文献200篇。 过程中得到纯化并同时复性。 3．成功地用普通SEC对Ecoli表达的rhG—CSF进行了复性并进行了部分纯化， 研究了流动相中脲浓度、流动相pH、流速、谷胱甘肽浓度和氧化还原比例， 以及甘油浓度等因素对rhG．CSF的SEC复性的影响。在优化的条件下，所得 rhG．CSF的比活为1．2×108 其质量回收率为30．1％，所用时I-廿J为 IU．m91。． 一 25 终的脲浓度对rhG。CSF复性的影响。与普通SEC相比，在流动相中有脲存在 并用脲梯度是一种更有效的SEC复性rhG—CSF的方法．能够更好地抑制复性 过程。}t聚集体的产生，所得rhG—CSF的比活为1．2×108IU．mg一，纯度为82．1％ 质量匝】收牢为52．8％，所川时n1J为30min。 4．采川强…离r交换色谱(sAx)法成JJJ地对8．0t001．L。脲变-m1勺rhG．CSF进iJ： 了复fl：j¨d时纯化，考察了流动十¨中脲浓度、流动4-II的pH值、流迷、氧化 的比活性 曲3．0X】08 IU-mg～，纯度为96．4％，质量刚收牢为49．3％，所 }H时111j为30min。而采用稀释法所衙rhG—CSF的比活性．为O．93×108 1U 1i但典 mg～，质引·』收率为32．7％，所川时IhJ为9h。‘j稀释法棚比，SAX 有较高的复性效率，『fIJ且省略了通常稀释复性方法eI，的稀释、离心除沉淀、 浓缩和上样等步骤。 rhG．CSF 5．将弱阴离子交换(WAX)色潜饼羽f fj勺复性并同时纯化，该法可在进 样时生成沉淀的条件下正常进行色谱操作。研究了流动相中脲浓度、赫种类、 缓冲液、流动相的pH值、流速、氧化还原对浓度比例等埘WAX色谱饼对 IU·m参1，纯度为95，8％，质量回收率为29，4％，所用时n≈为25rain。 了流动相中脲浓度、流动相pH、缓冲液种类和“。汕浓度对rhG．CSF复性的 影响。在优化的条件下，所得rhG-CSF的比活性为2．3x 108IU．m91。，纯度为 IU 比活性仅为O．81×】08 rmg～，质量回收率为27．2％，所用时川为9h。这也是 首次将IMAC用于非融合蛋白的复性。 铵浓度、缓冲液种类、流动棚pH值、流速和同定棚等对rhG．CSF复性的影 响。在优化的条件下，经一步HPHIC后，难28 min内rhG—CSF可以得到复 性，并同时得到纯化，其比活为2．1×108 IUmg～，纯度为96．8％，复性及纯 周期短，容易放大，可应川于rhG．CSF的人胤模生产。 8．对HPHIC复性rhG—CSFfI‘J2E艺进行了放大，川10×200mlTl I．D．HPHIC色谱 饼在孙Ik规模．I-x．．t rhG—CSF进行