β-防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞Hepa1-6中的稳定表达.pdf

梅寒芳等 B一防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞 Hepal-6中的稳定表达 第 9期 ·1213· p一防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞 Hepa1-6中的稳定表达 梅寒芳 金小宝 朱家勇 (广东药学院广东省生物活性药物研究重点实验室，广东 广州 510006) [摘 要] 目的 克隆抗菌肽B防御素2(mBD2)基因，构建真核分泌性表达载体，使其在Hepal-6细胞中稳定表达。方法 Tfizol试剂提取 C57BIM6鼠肾总 RNA，RT．PCR扩增 mBD2成熟肽基因，Overlap．PCR在成熟肽基因上游加上 鼠IgK信号肽基因，克隆至真核表达载体 pcDNA3．1 (+)，PCR、酶切和测序鉴定正确后，脂质体法转染Hepal-6细胞，G418筛选，RT—PCR和Western印迹法从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表 达。结果 成功克隆含有信号肽的IgK—mBD2序列，并且构建peDNA3．1(+)／IgK-mBD2真核分泌性表达载体，实现了mBD2分子在Hepal-6细胞中 稳定表达 ，RT—PCR从细胞总 RNA中扩增得到202bp的IgK—mBD2基因，Western印迹法鉴定细胞培养上清中有mBD2蛋 白分子表达。结论 成功构 建 了peDNA3．1(+)／IgK．mBD2真核分泌性表达载体，转染得到稳定表达mBD2的Hepal-6细胞株，为进一步研究mBD2的生物学特性及抗肝癌机制 奠定细胞学基础 。 [关键词] 防御素；天然免疫；肝癌；Ovedap—PCR (中图分类号] R737．31 [文献标识码] A [文章编号] 1005-9202(2010)09-1213-03 Constructionofbeta-defensin2secretoryeukaryoticexpressionvectorandidentificationofstableexpressionofmBD2 in Hepal-6 ceH MEIHan·Fang，JIN Xiao-Bao，ZHUJia-Yong． GuangdongKeyLaboratory ofPharmaceuticalBioactiveSubstances，Guangzhou510006，Guangdong，China A【bstract】 Objective Toclonebetadefensin2(mBD2)genefromtotalRNAofmousekidney，andtoconstructmBD2secretary eukaryoticexpressionvector，thenrealizeitsexpressioninHepal-6cells．Methods TotalRNA wasisolatedfrom kidneyofC57BL／6mice byTrizolreagent．DNA sequencecodingformaturemBD2wasamplifiedbyRT—PCR．ToaddamurineIgK signalpeptidesequencebyover- lap—PCR．AftersuccessfullyT—Aclone，IgK—mBD2wassubclonedintotheplasmidpcDNA3．1(+)．ThepcDNA3．1(+)／IgK—mBD2was identifiedbyPCR，endonucleasedigestion，andsequencing．TheHepa1-6cellsweretransfectedwithpcDNA3．1(+)／IgK—mBD2byLipo— some2000andselectedwith400mg ／LCA I8for8w．IdentificationofsteadyexpressionofmBD2wasconfirmedbyRT—PCR andW estern blot．Results Theeukaryoticexpressionvector—pcDNA3．1(+)／IgK—mBD2wassuccessfullyconstructed．Stableexpressionalcelllineof Hepa1-6wasobtainedbytransfectingpcDNA3．1(+)／IgK—mBD2intoHepa1-6byLiposome2000．ThesteadyexpressionofmBD2was confirmedbyRT—PCRandWestern blot．Concl