实验四.感受态细胞的制备、转化及转化子的筛选.pptVIP

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2017-08-26 发布于重庆
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实验四.感受态细胞的制备、转化及转化子的筛选.ppt

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实验四：感受态细胞的制备、转化及转化子的筛选一、实验目的了解CaCl2制备感受态细胞的原理，掌握制备的方法；掌握大肠杆菌热转化的方法；掌握转化子的筛选原理及步骤。二、实验材料与仪器实验材料：大肠杆菌TG1菌株，含Amp抗性基因的pEGFP载体实验试剂： 0.1M CaCl2溶液，15% 甘油的 0.1M CaCl2溶液，LB液体培养基，LB固体培养基，0.1M 氨苄青霉素；冷冻离心机，水浴锅，超净工作台。 LB液体培养基： Tryptone 10g Yeast Extract 5g NaCl 10g 加去离子水1L，用NaOH调PH值至7.0，高温高压灭菌后4℃保存。（如制作固体培养基，应加Agar 15g/L）三、实验步骤 CaCl2制备感受态细胞 1. 从新活化的大肠杆菌TG1平板上挑取一单菌落，接种于3-5ml的LB液体培养液中，37℃振荡培养12h； 2. 将上述培养液以1:50-1:100转接于100ml LB液体培养基中， 37℃振荡扩大培养，1-1.5h后测OD600，至≤0.5时停止培养； 3. 取1.5ml的上述菌液转入1.5ml灭菌离心管中，在冰上冷却30min，于4℃ 4000 rmp离心10min；（从这一步起，之后所有操作均应在冰上进行，速度尽量快而稳） 4. 倒净上清液，用1ml冰冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬浮细胞（可以用枪头来回吹打，不用剧烈），冰浴， 4℃ 4000 rmp离心10min； 5. 弃去上清液，加入500μl冰冷的0.1M CaCl2溶液，小心悬浮（方法同上）。冰浴， 4℃ 4000 rmp离心10min； 6.弃去上清液，加入100μl含15%甘油的冰冷的0.1M CaCl2溶液，小心悬浮（方法同上），冰上放置片刻后，即成感受态细胞。（感受态细胞在-70℃下可保存半年至一年）热击转化法 1. 加入一定量的DNA分子加到100μl的感受态细胞中，冰上放置30min； 2. 42℃加热45s后，立即放在冰中1min； 3. 然后加入到1ml的LB液体培养基中，37℃振荡培养1h； 4. 取上述培养液50μl涂在含有Amp的LB固体培养基表面进行筛选。 5. 12h后观察LB固体培养基平板长菌情况。四、实验结果与思考题拍照转化子的筛选情况，并分析结果。 * *