DNA的提取及含量测定实验.pptVIP

DNA的提取及含量测定 [实验目的及要求]  1.学习和掌握用浓盐法从动物肝脏中提取DNA的原理和方法； 2.学习和掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。 [实验原理] 1．DAN的提取 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及细胞质中。动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液，但在0.14mol/l的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/l盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。 2? DAN的含量测定 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。在DNA浓度为20-200μg/ml的范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。 [实验仪器及用品] 实验器材：猪肝、722型分光光度计、匀浆器、离心机、恒温水浴锅。 实验试剂：0.1mol/l NaCL-0.05mol/l柠檬酸钠溶液、0.015mol/L NaCL-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液、95%乙醇、NaCl固体、5%SDS、氯仿、DNA标准液、二苯胺试剂。 [实验内容及步骤] 一、动物肝脏中DNA的提取 1．取猪肝8g，用匀浆器磨碎，加入相当2倍肝重的0.1mol/L NaCL-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min下离心10min；沉淀中再加入25ml缓冲液，于4000r/min离心20min；取沉淀。 2．在上述沉淀中加入40ml0.1mol/L NaCL-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、20mlCHCl3-异戊醇混合液、4mL5%SDS使其浓度为0.41%，振摇30min，然后缓慢加固体NaCl，使其终浓度为1mol/L。将上述混合液在3500r/min离心20min，取上清水相。 3．在上述水相溶液中加入等体积冷95%乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗制品。用蒸馏水溶解并定溶至50ml，用二苯胺法测定DNA含量。 二、DNA的定量测定（二苯胺法） 1．标准曲线的绘制 按下表加入各种试剂，混匀，于60℃恒温水浴中保温45min，冷却后，在595nm波长下，于722型分光光度计上比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，绘制标准曲线。 样品的测定 吸取样品1.0mL，加入蒸馏水1.0ml，混匀。然后准确加入二苯胺试剂4.0ml，混匀，于60℃恒温水浴保温45min，冷却后，选595nm波长，于722型分光光度计上比色测定，根据测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。 3．计算100g猪肝中DNA含量 ω= m1/m2 式中 ω：DNA的质量分数； m1：样液中测得的DNA的质量； m2：样液中所含样品质量。 三、实验现象及数据处理 仔细观察所得到的DNA，记录其形状、颜色。在含量的测定时，绘制出标准曲线，查出其浓度，并换算成质量，然后代入公式中计算出DNA的含量。 * * A595nm 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 二苯胺试剂/ml 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水/ml 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 标准DNA溶液/ml 5 4 3 2 1 0