细胞培养液的配制.ppt

磁力搅拌器充分搅拌 准备过滤 ⑥ 无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道是否通畅。 (一般使用氧气。注意气压适当, 防止滤膜破裂，) 将液体倒入无菌滤器，接通气体 ⑦过滤后的液体分装于贮液瓶 分装过程严格无菌操作 分装后的液体贮存于4℃，2周内用完。 细胞培养液的配制 培养基的选择 依据: 经验、文献、尝试 常用: RPMI1640、DMEM 培养基的来源 市售干粉培养基---自己配制 液体培养基---直接使用(注意有效期) 培养基的除菌方法 过滤除菌: (1) 正压过滤---效率高 (2) 负压过滤---效率低 高压蒸气灭菌: 不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加 培养基附加成分的添加 按使用说明或实验要求添加 配制时加: 碳酸氢钠、抗生素、血清等 临用前加: 生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等 RPMI1640培养液配制过程 准备物品 (1) 不锈钢过滤器, 滤膜(0.45μm,0.22μm),磁力搅拌器,天平,烧杯,量筒,盐水瓶 (2) 培养粉,1N HCl,NaHCO3,青霉素,链霉素,胎牛血清,新鲜三蒸水 消毒物品 滤器中放置0.45μm和0.22μm滤膜, 包装, 高压蒸气消毒 配制步骤 (1) 10.4g/包培养粉溶至1L三蒸水中, 磁力搅拌20min (2) 加2g NaHCO3/L, 继续搅拌10min (3) 加青霉素100U/mL(80万U溶至4ml三蒸水, 取0.5ml) 链霉素100U/mL(100万U溶至5ml三蒸水, 取0.5ml)) (4) 加1N HCl约3mL, 调pH至7.2, 继续搅拌 (5) 按要求加血清　（血清一般需经56℃，30min灭活） 例如: 10%胎牛血清 无血清培养液 900ml 灭活胎牛血清 100ml (6) 正压过滤除菌 (气压适当, 防止滤膜破裂) (7) 分装,贮存于4℃，2周内用完。 (8) 无菌试验: 取样, 37℃放置24－72h, 无细菌、霉菌污染方可使用 注意事项 谷氨酰胺在溶液中很不稳定，４℃，７ｄ分解５０％，放置两周以上时，根据需要添加谷氨酰胺。配制１００×母液（200 mmol/L, 即29.22g/L）, 每100ml加入0.5－2 ml母液，终浓度1－4 mmol/L 抗生素在37℃稳定性维持3－4d, 可控制轻度污染。防污染重在无菌操作 培养液配制过程 （以RPMI1640为例） 1. 物品准备 (1）滤器、 微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、pH计、贮液瓶等。 (2) 培养粉、 NaHCO3、 1N HCl、青霉素、链霉素、血清、新鲜制备的三蒸水 2. 滤器消毒准备 取孔径为0.45μm和0.22μm滤膜各一张，浸入三蒸水中 将浸湿后的滤膜光面向上依次置于滤器上 将装有滤膜的滤器包装后高压蒸气消毒 3.液体配制 ① 将培养粉倒入容器中 ②加入新鲜制备的三蒸水磁力搅拌器充分搅拌 ③按照实验的具体要求分别加入 NaHCO3和青链霉素（青霉素100U/mL：80万U溶至4ml三蒸水, 取0.5ml； 链霉素100U/mL：100万U溶至5ml三蒸水, 取0.5ml) ④按要求加入一定比例的血清（血清一般需经56℃，30min灭活） 例如: 配制含10%胎牛血清的RPMI1640培养液1升，应加入 无血清培养液900ml 灭活胎牛血清100ml ⑤加入1N HCl约3mL,调整pH至7.2－7.4