小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建_医学论文.doc免费

小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建_医学论文 小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建_医学论文 【摘要】 应用RT-PCR方法，从小鼠脾脏T细胞的mRNA中，扩增获得编码小鼠趋化因子CXCL10的cDNA，并加上人单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因，将其克隆到Pucm-T载体，经酶切及测序鉴定，进而构建CXCL10重组真核表达载体。采用脂质体法体外转染COS-7真核细胞，经Western blot和趋化指数检测，转染细胞能够表达CXCL10蛋白，其上清对淋巴细胞具有趋化作用。CXCL10的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。 【关键词】 CXCL10；基因克隆；真核表达载体 Gene cloning and eukaryotic expression vector construction of murine CXCL10 【Abstract】 The cDNA fragment encoding the murine CXCL10 was obtained from mRNA of mouse T cells by using reversal transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR)and contained a signal peptide derived from the human monocyte chemoattractant protein 1, then it was cloned into the Pucm-T vector. By partial nucleotide sequencing, the cDNA was consistent with the reported mCXCL10 cDNA in the gene bank, and then was inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). The recombinant plasmid was transfected into COS-7cell line by DOTAP liposome. The expression of the target molecule was assayed by Western blot and chemotaxis assay.It was found that the cells transfected with plasmid vector could express mCXCL10 protein and it’s culture supernatants could attract T cells markedly. The successful construction of mCXCL10 eukaryotic expression vector lays the foundation for it’s further researching in treatment of tumor. 【Key words】 CXCL10 gene cloning eukaryotic expression vector 趋化因子CXCL10 (IFN-γ inducible protein-10, IP-10)，属于CXC家族的非ELR趋化因子，主要由活化的单核及巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生。CXCL10的受体CXCR3，属于具有7个跨膜区的G蛋白偶联受体，由活化的T细胞等表达，CXCL10与其结合后发挥趋化作用，能够诱导活化的T细胞等趋化。另外，CXCL10还能够抑制肿瘤血管生成［1～3］。基于CXCL10的多种生物学效应，国外已开展CXCL10在肿瘤和感染性疾病等方面的应用研究。本实验旨在构建小鼠CXCL10真核表达质粒，探讨其在真核细胞中的表达，为进一步研究CXCL10的生物学活性及肿瘤的基因治疗奠定基础。 1 材料与方法 1．1 载体、菌株及主要试剂 大肠杆菌DH5α、Pucm-T载体和真核表达载体pcDNA3.1(+)原购自Invitrogen公司。COS-7细胞购自中科院上海细胞生物所。RT-PCR试剂盒、限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ购自Promega公司。T4DNA连接酶和TaqDNA 聚合酶购自Promega公司。DNA片段回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自华美公司。鼠重组CXCL10细胞因子和兔抗鼠CXCL10多克隆 抗体为PeproTech公司产品，抗兔IgG-HRP为Santa Cruz公司产品。DOTAP脂质体转染试剂盒购自Roche公司。尼龙毛为日本和光纯药工业株式会社产品。引物合成及测序由上海申能博彩公司