格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响_医学论文.docVIP

格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响_医学论文 格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响_医学论文 【摘要】 目的： 探讨格列吡嗪（Glip）对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道（mito KATP）的影响. 方法： 取分离鉴定的Wister大鼠和2型糖尿病GK大鼠心肌组织线粒体悬浮液,加入到含有K+和KATP通道阻滞剂ATP的待测溶液中,再按如下分组进行药物干预,即空白对照组（Con组）、特异性mitoKATP激活剂二氮嗪组（Dia组）、Dia+Glip组（分别为5，50 μmol/L Glip）,即刻检测溶液在3 min内光散射值的变化,以此作为反映线粒体体积变化的指标. 结果： 各组线粒体体积均随时间增大,Con组增加速度极慢,Dia组最快,而Dia+Glip组则介于两者之间.不同浓度Glip均能使两种大鼠线粒体体积增加速度减慢（0.01）,高浓度作用更明显（0.01）；相同浓度Glip对不同大鼠组的影响程度不同,对糖尿病GK大鼠的影响明显弱于正常大鼠（0.01）. 结论： Glip对正常及糖尿病大鼠心肌mitoKATP均有关闭作用,但对糖尿病大鼠的作用明显较弱. 相当于临床治疗中血药浓度峰值的Glip浓度（5 μmol/L）虽可干扰正常大鼠心肌mitoKATP的活性,但对糖尿病大鼠心肌mitoKATP无显著影响. 【关键词】 格列吡嗪 糖尿病 心肌 线粒体ATP敏感性钾通道 0引言 磺脲类药物因为高效的降糖作用而广泛应用于2型糖尿病的治疗. 它主要通过结合胰岛β细胞膜上磺脲类药物受体（sulfonylurea receptor,SUR）引起细胞膜上ATP敏感性钾通道（ATP）关闭而发挥作用.但研究证实大部分磺胺类药物也能关闭心血管组织的KATP［1］. 而后者在心肌缺血时的激活对于启动心肌缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC），降低缺血对心肌的损伤发挥着主要作用,并且线粒体ATP敏感性钾通道（mitoKATP）相对于细胞膜ATP敏感性钾通道所起的作用更重要,mitoKATP是IPC的最终效应器［2-3］.目前已明确磺脲类药物格列吡嗪（Glip）对心血管组织sarcKATP有阻滞作用,但少见其对心血管mitoKATP直接影响的报道. 我们应用线粒体悬浮液定量光散射测定技术研究Glip对正常及糖尿病大鼠心肌mitoKATP的影响，探讨Glip对缺血性心肌的安全性、指导临床对缺血性心脏病患者降糖药的选择. 1材料和方法 1.1材料8~9 wk雄性Wister大鼠和糖尿病Goto大鼠各20只，体质量220~250 g(上海斯莱克实验动物有限公司)；Glip纯品（上海信谊内分泌公司）；蔗糖、硫酸铜、酒石酸钾钠、琥珀酸钠、丙二酸、延胡索酸（国药集团化学试剂有限公司）；蛋白酶（Invitrogen公司）；牛血清白蛋白（Spanish公司）；二甲亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）（Amresco公司）；HEPES，ATP（Roche）公司；Percoll（Pharmacia公司）；二氮嗪（Diazoxide），鱼藤酮、寡霉素（Sigma公司）；高速冷冻离心机（Beckman公司）；723型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）. 1.2方法 1.2.1线粒体制备大鼠禁食过夜,断头处死,迅速取出心脏. 依据Riess等［4］的方法提取线粒体,略作改动,简述如下：用少量冰预冷分离介质(250 mmol/L蔗糖,10 mmol/L HEPES,5 mmol/L K用NaOH调pH至7.2)漂洗心脏,在含1 g/L蛋白酶的分离介质中剪碎心脏至肉糜状,分离介质用5 g/L牛血清白蛋白调整至2.5倍体积,用匀浆器制成匀浆液,1700 g离心4 min,取上清液9000 g离心5 min,将沉淀吹打重悬浮于分离介质中,2300 g离心2 min,收集上清液,9000 g离心5 min,得到线粒体沉淀,将沉淀重悬浮于不含K的分离介质中.采用自发形成Percoll密度梯度的方法进一步纯化线粒体.最后将所得线粒体沉淀以蛋白浓度35~40 g/L悬浮在不含K的分离介质中,冰浴中保存备用. 以上操作均在0~4℃进行,从动物处死到首次离心间隔少于4 min. 参照Castilho等［5］方法 ，用测定线粒体内膜关键酶琥珀酸脱氢酶活性法进行线粒体鉴定. 双缩脲法测定线粒体蛋白浓度. 1.2.2线粒体体积测定用定量光散射技术测定线粒体体积变化. 当线粒体悬浮液中线粒体蛋白浓度为0.1 g/L时,在经过蛋白浓度无限大时吸光度值校正后,线粒体悬液光散射值β与溶液在520 nm，25℃的吸光度值的倒数呈线性相关［4］. 因此反映线粒体体积变化的线粒