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牛IL_医学论文 牛IL_医学论文 作者：田兆菊, 郑玉姝, 胡敬东, 赵宏坤 【关键词】 BoIL 　　[摘 要] 目的: 在杆状病毒表达载体中表达牛白细胞介素18(bovine interleukine18, BoIL18)成熟蛋白基因, 并鉴定其生物学活性。方法: 设计一对特异性引物, 将编码BoIL18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTb上, 构建重组质粒repFastBac HTb18, 转化至DH10Bac感受态细胞中得到重组Bacmid（BacmidBoIL18）。在Cellfectin作用下, 将BacmidBoIL18转染昆虫细胞sf9获得重组杆状病毒, 然后将重组杆状病毒感染sf9, 感染后不同时间收获sf9细胞, 进行SDSPAGE电泳, 分析表达情况 用BoIL18的原核表达产物作为抗原制备的兔多克隆抗体进行Western blot分析 将纯化的表达产物对牛外周血单个核细胞（PBMC）进行细胞增殖试验, 对健康牛脾进行IFNγ诱生试验, 初步分析表达产物的生物学活性。结果: BoIL18成熟蛋白基因在昆虫细胞中获得了表达, 经薄层凝胶扫描分析证实, 表达量占总蛋白的213% Western blot分析证明, 在相对分子质量（Mr）约为26000处有一条特异性条带。生物学活性分析表明, 纯化的表达产物可明显增强淋巴细胞增殖, 促进IFNγ的产生。结论: BoIL18成熟蛋白基因在昆虫细胞中获得了表达, 表达产物具有良好的生物学活性。 　　[关键词]BoIL18成熟蛋白基因杆状病毒表达载体系统 昆虫细胞 生物学活性 　　白细胞介素18(IL18)是Okamura等[1]首次从小鼠肝脏中克隆获得的,除能强烈地诱导免疫细胞释放IFNγ、 GMCSF、 TNFα等多种细胞因子外, 也具有增加FasL 的表达以及增强NK细胞毒性作用等多种生物学效能, 在免疫调节、 抗感染及慢性炎症性疾病发病过程中起着重要作用[2]。杆状病毒表达载体系统是最具有应用前景的真核表达系统之一。它具有对外源基因容量大, 操作方便、 不污染环境等优点, 并且能使表达产物得到充分地翻译后修饰。本实验室已经构建了牛白细胞介素18(BoIL18)的重组质粒PMDTBoIL18, 在此基础上设计一对特异性引物, 通过PCR扩增, 将BoIL18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒表达载体, 通过转染昆虫细胞sf9, 得到了BoIL18的高效表达产物 经对牛PBMC的增殖与对脾IFNγ的诱生试验证实, 表达产物具有良好的生物学活性, 为进一步研究及应用BoIL18提供了实验依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 昆虫杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac HTb由哈尔滨兽医研究所童光志教授惠赠 DH10Bac、 草地贪夜蛾细胞（Spodoptera frugiperda 9, sf9）由山东农业大学动物科技学院崔治中教授惠赠 重组牛白细胞介素18（PMDTBoIL18）由本实验室构建并保存 抗BoIL18的多克隆抗体是由本实验室用纯化的BoIL18的原核表达产物免疫兔制备 DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程公司 各种限制性内切酶、 T4 DNA 连接酶、 rTaq酶等购自TaKaRa公司 Sf900 II SFM无血清培养基、 Cellfectin转染试剂均购自Invitrogen公司 NiNTA纯化预装柱购自北京卓冠科技有限公司 羊抗兔IgG、 MTT购自Sigma公司 bIFNγ ELISA包被抗体与检测抗体购自Mabtech公司 淋巴细胞分离液购自上海生化试剂厂。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物设计与PCR 扩增 根据已发表序列设计一对引物, 委托上海生物工程公司合成, 对BoIL18的成熟蛋白基因进行PCR扩增。序列如下: 上游引物(P1): 5′TATCCATGGATCACTTTGGCAAACTTGAAC3′, 带有Nco I酶切位点及起始密码子 下游引物(P2): 5′ATCGAATTCCTAGTTCTGGTTTTGAACAGT3′, 带有EcoR I酶切位点及终止密码子。PCR反应条件为: 95℃ 5 min, 充分变性后进入循环体系: 94℃ 45 s, 60℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共35个循环, 然后72℃延伸8 min。 　　1.2.2 重组转移载体的构建及鉴定 将回收纯化的PCR产物和转移载体pFastBac HTb分别用Nco I与EcoR I进行双酶切, 回收BoIL18基因片段及线性化的pFastBac HTb, 用T4 DNA连接酶连接, 构建重组转移载体repFastBac HTb BoIL18, 转化至DH5α, 挑取单菌落, 提取质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定,