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石油降解细菌的分离提纯及简单应用 内容简介： “油田采出水”，也称“油田污水”。油田污水中不仅含有原油，还溶进了地层中各种盐类、悬浮物、有害气体和有机物,BOD5/ CODCr值仅有0. 15～0. 3 左右。在原油处理时还掺进了大量高分子化学药剂，形成一种特殊的难降解的有机废水。就此状况及特点，及目前应用于含油废水处理的各种生物处理方法，以及生物处理的原理表明，高效原油降解菌和生物处理构筑物相结合的生物深度处理技术是国内油田污水处理技术发展的趋势。随着生物处理技术的不断发展，越来越多的生物处理方法被应用于油田污水的处理,并获得了良好的处理效果。 关键词：高效降油菌、石油污染土壌、接种、提纯、 生物修复 正文： 随着石油工业的发展， 含油废弃物的污染范围不断扩大， 污染程度也日益严重， 对其进行治理有着重要的现实意义。80年代以来， 污染土壤的生物修复技术由于具有费用省、操作简单和环境影响小的特点， 越来越受到关注, 并得到广泛应用。土壤中广泛分布着可降解石油的微生物种,它们在土壤生物修复中具有重要作用，但是数量上相差很大。土壤中降解石油微生物的数量与污染物的存在有着密切关系。它们能够适应环境,然后进行选择性富集并发生遗传改变，从而导致烃类降解细菌所占比例及编码降解烃类基因的质粒数量增加。有报道指出，降解烃类的微生物一般只占微生物群落总数的不到1 %，而当有石油污染物存在时,降解者的比例增加到10 %。此方法基本实现对不同污染程度、不同类型的污染修复的相应处理手段，研究结果为含油废弃物的土壤异位生物修复技术的实用化提供了试验依据。 优质石油降解细菌的培养筛选方法 菌种的采集：被石油污染的土壤中的细菌 培养基：NH4NO3 2g ， K2HPO4 1. 5g， KH2 PO4 3g，MgSO4·70H2O 0. 1g，无水CaCl2 0. 01g，Na2 EDTA·2H2O 0. 01g，原油1g，蒸馏水: 1000mL， pH值7. 2～7. 4. 操作方法（即石油降解菌的富集、分离、纯化）：取一定量的石油污染土样接入装有100mL 培养基的250mL 三角瓶中，于30℃、160 rmin- 1条件下在摇床中培养7d，然后取一定量的上述培养液接入装有100 mL新鲜培养基的250mL三角瓶中， 30℃、160 r·min- 1条件下摇床中培养7d;如此共3次。 用接种环沾取富集培养液于平板上划线， 经过多次划线纯化后，将纯化菌株于试管斜面培养后保存于冰箱。石油降解菌的复筛：称取含油土样50g，溶于经灭菌的培养基100mL 中，配成泥浆，盛于250mL 的三角瓶中，在无菌条件下，将制好的菌悬液接种2mL于三角瓶中，各菌种均做3个平行样，并作加氯化汞杀菌和不加菌2种空白对照。 在30℃、160 r·min- 1条件下于摇床中培养。 每2d取1次样，测其石油烃含量,直至其石油烃含量不再有明显变化，筛选出石油烃降解率高的菌种。 接种量影响试验的操作方法与菌种复筛的方法相同。不同的是改变接种量和试验土样。 样点1、样点2、样点3、样点4的泥浆中石油烃浓度分别为125mg·L - 1、56 mg·L - 1、3245mg·L - 1、209 mg·L – 1。石油降解菌的生物修复：称取含油土样2kg于圆形瓷盆中，将斜面培养的细菌进行活化，与锯末(1∶7,质量比)制成固体培养基，接入石油污染土壤中。土壤含水率基本保持在20%左右,在自然温度下进行修复。 实验的基本结果 1、高效降油菌的筛选： 为了取得高效、彻底的生物修复效果,分离和筛选污染物的高效降解菌种是生物修复的必然要求。试样经过3次富集培养以及分离纯化等步骤得到多个单菌株。 在此基础上,采用降解石油试验，复筛出7株对石油具有较高降解能力的菌株。细菌密度可达107 ～109个·mL - 1 ，株菌可以利用石油为唯一碳源生长。培养7d后的生物除油率为43. 8%～58. 9% ，高于一般石油降解菌对石油类的降解率（ 25. 8% ～32. 8% ）对所筛选的7株菌进行生理生化试验表明，这可能是由于革兰氏阴性菌细胞外层是脂多糖,而脂多糖是由脂类和多糖组成的复合物，可以为细胞提供一个既亲水又亲油的两亲分子层，这一方面使其细胞与油滴表面接触，使石油烃易于进入细胞，另一方面，它能降低水- 油界面张力，使原油变为由细小油滴构成的乳剂，并扩散进入细胞,加速油的降。 2、高效降油菌对石油的降解能力试验中设置了加氯化汞杀菌对照试验和不加菌的空白对照试样。 实验表明，加氯化汞的杀菌试样石油烃降解率为9%的水平 ，随着降解时间的延长石油烃降解率基本不变，最高为12%。加氯化汞杀菌试样中石油烃减少的主要原因为石油烃挥发和空气氧化的作用。不加菌和氯化汞对照试样2d后的降解率为11% ，降解率随时间的延长逐渐增