应用基因芯片技术研究白花蛇舌草豆甾醇抑制人肝癌细胞生长的靶基因调控.pdfVIP

应用基因芯片技术研究白花蛇舌草豆甾醇抑制人肝 癌细胞生长的靶基因调控 1 2 1 张硕 ，宋衍芹 ，岳旺 1. 青岛大学医学院药学系，山东青岛（266021 ） 2. 青岛市市立医院口腔临床医学中心，山东青岛（266071 ） E-mail ：dr_zhangshuo@ 摘 要：目的应用基因芯片技术研究白花蛇舌草豆甾醇(Stigmasterol from Hedyotis diffusa willd.,SHD)抑制人肝癌细胞SMMC-7721 生长的靶基因调控。方法 分别提取人正常肝细胞、 人肝癌SMMC-7721 细胞和SHD 作用后的SMMC-7721 细胞的总RNA ，逆转录合成单链、 双链cDNA 后，体外转录合成生物素标记的 cRNA 与人HO4 基因表达谱芯片杂交，扫描 杂交芯片图像，利用软件获得 SHD 抑制人肝癌的靶基因，对其进行生物信息学分析。结 果 SHD 使癌基因fos、myc 、ras 、pim-1 、met 、rel 下调至正常水平，使抑癌基因NF-2 和 磷酸激酶MAP2K6 的表达上调至正常水平。结论 SHD 抑制SMMC-7721 细胞的作用由多 条靶基因协同，并通过胞内外信号转导途径协调完成。 关键词：白花蛇舌草；豆甾醇；人基因芯片；人肝癌细胞SMMC-7721；抑制作用 前言 白花蛇舌草(Hedyotis diffusa willd.)是茜草科耳草属植物，为中医治疗肝癌的要药。据 统计，在治疗原发性肝癌的50 味高频使用的中药中，白花蛇舌草位列第四[1] 。近年来，我 们对其成分进行了大量细胞毒性筛选，发现其成分豆甾醇具有一定的抗肿瘤活性，与文献 报道结果一致[2] 。经体内外实验，我们证明白花蛇舌草豆甾醇(Stigmasterol from Hedyotis diffusa willd.,SHD)对肝癌具有良好的生长抑制作用。为研究SHD 抗肝癌机理，我们采用基 因芯片技术探查其抑制人肝癌细胞SMMC-7721 的靶基因，并对靶基因进行生物信息学分 析。 1. 材料与方法 1.1 材料 白花蛇舌草经鉴定后，由成都中医药大学药学院药物化学教研室提取SHD （经检测， 其纯度为83.57%），经50%乙醇溶解，RPMI-1640 （Gibco ）稀释至1000 µg/ml，0.22 µm 滤膜过滤除菌；人肝癌细胞SMMC-7721 瘤株，由四川大学华西医学中心肿瘤研究所提供； 人肝正常细胞，由成都中医药大学附属医院提供；ExpressChipTM 基因芯片系统的人 HO4 基因芯片（为包含 3360 个点的寡核苷酸基因芯片，基因列表见网址： ），由美国Mergen 公司提供。 1.2 方法 设肝正常细胞组、肿瘤细胞组和给药组。获得正常肝叶组织后，采用“原位两步灌注法” 体外灌注分离肝组织，获取正常人正常肝细胞[3,4] 5 ，按 1×10 /mL 接种于培养瓶中，设为肝 正常细胞组。将人肝癌细胞SMMC-7721 接种于培养瓶，37°C 培养18 h 使细胞贴壁，分别 设给药组和肿瘤细胞组，给药组加入FHD 溶液，使其终浓度为10 mg/L；肿瘤细胞组不加 药。各组细胞设定、加药完成后，于50 mL/L CO2 、37°C 条件下继续培养48 h 。根据TRIzol Reagent （Life Technologies Inc ）的步骤提取总RNA ，通过10 g/L 琼脂糖电泳检验质量， -1- 并使用UV 分光光度计侧RNA 的浓度和纯度，浓度须达到要求