核酸杂交的镧系元素发光时间分辨荧光分析中关键试剂的研制.pdfVIP

核酸杂交的镧系元素发光时间分辨荧光 分析中关键试剂的研制 宋娜玲赵启仁李美佳褚丽萍周伟玲颜廷东贺欣张春明 (中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所，天津市分子核医学重点实验室，300192天津) 摘要 目的研制成核酸杂交的镧系元素发光时间分辨荧光分析中的关键试剂。方法用过碘 酸钠法研制成辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(SA)，用戊二醛二步法研制成碱性磷酸酶(ALP) 标记链霉亲和素和用化学合成法研制成5一氟水杨酸磷酸酯(5一FASP)等关键试剂。结果HRP标记 SA总蛋白回收率为29．8％，纯度为97％。ALP标记SA的总蛋白回收率为56％，纯度为98％，分子量 纯度为99．43％～100％、红外吸收光谱、紫外吸收光谱及核磁共振谱等特性鉴定与文献记载一致。结 论研制成的各种关键试剂均符合本实验的要求。 关键词 时间分辨荧光分析；辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；碱性磷酸酶标记链霉亲和素； 5一氟水杨酸磷酸酯 核酸杂交的镧系元素发光时间分辨荧光分析的基本原理如下口，2’引：先用抗体包被微 滴定孔，再经特异抗原标记的靶DNA与该抗体反应，将靶DNA连接到固相抗体上。然后 用生物素化探针与靶DNA杂交，再通过生物素(B)与链霉亲和素(SA)的反应，将链霉 亲和素标记的辣根过氧化物酶(1tRP～SA)连接到杂化物上。当加入含有H：0：和生物素化 同时，也催化事先固定在微滴定孔表面的蛋白质(如白蛋白)的酪胺酰基的氧化。由于 二聚体形成反应，于是生物素化酪胺(B-T)就共价地结合到固相上。再加入碱性磷酸 基金项目：天津市自然科学基会(批准号：043610211) 都不干扰信号测量，可用时间分辨荧光仪直接测量荧光强度，确定待测DNA的量，而无 需另行分离，方法很简单。本分析系统主要包括关键试剂的研制和分析系统的建立，本 文介绍了HRP标记SA、ALP标记SA和5-FSAP等关键试剂的研制。 1材料与方法 1．1材料 GelGradient IEF， 8-25％和Agarose 亲和素(SA)，美国Promega公司；标准蛋白，Phast 瑞典PharmaciaBiotech公司：高碘酸钠，硼氢化钾，天津市大茂化学试剂厂；对一氟 茴香醚，Sigma公司；紫外分光光度仪(DU800型)，美国Beckman公司；Phastsystem 水平电泳仪，瑞典Pharmacia 仪器厂；离心机(LD5—2A型)，北京医疗离心机厂； ’ 1．2方法 1．2．1辣根过氧化物酶标记链霉亲和素 1．2．1．1HRP-SA的合成 采用过碘酸钠法。过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的 NaIO。 部分)的羟基氧化成醛基，然后与SA的氨基结合，形成HRP—SA。HRPlmg与60mmol／L 于4℃作用20min，加入0．16mol／L乙二醇30min后，加SA img，4℃静置24hr，透析 pH7．4PBS 吸光度并进行波长从200nm800nm扫描。 1．2．1．2 HRP-SA的纯化 将处理好的sephadex u KCl—0．2mol／1乙酸缓冲液淋沈20分钟，平衡。取100l标记好的HRP-SA，沿管壁慢 慢加入层析柱中，用乙酸缓冲液以0．5ml／2分钟的速度淋洗，分部收集淋洗溶液，用 DU800紫外分光光度计测量收集的各管样品的OD姗值，绘制柱层析图谱(洗脱曲线)，据 此收集蛋白峰。透析脱盐和用PEG-2000进行浓缩。 1．2．2碱性磷酸酶标记链霉亲和素 1．2．2．1ALP-SA的合成 49 采用戊二醛二步法：在ALP中加入过量戊二醛，戊二醛的一个醛基即与ALP的氨基 结合，充分透析除去未结合戊二醛，加SA与结合了ALP的戊二醛的