携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定.pdfVIP

第37卷 第2期 2014年4月 遵 义 医 学 院 学 报 V01．37 NO．2 Journ~ ofZunyiMedicalUniversity Apr．2014 携带hTERT基 因的重组慢病毒载体的构建及鉴定 张青峰 ，张芳婷 ，申慧芳 ，高书颖 (1．遵义医学院珠海校区 生物化学与分子生物学教研室，广东 珠海 519041；2．北京大学深圳医院 中心实验室 ，广东 深 圳 518036) [摘 要]目的 构建携带人端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因的重组慢病毒载体，并鉴定其在 HeLa细胞中的表达。方法 采用 Gateway技术使克隆载体pENTR221一hTERT与慢病毒表达载体pLenti6．3／V5一DEST进行重组反应，构建重组慢病毒载体 pLenti6．3／V5一hTERT；将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP／VSVG共转染人胚肾293Fr细胞，制备重 组慢病毒颗粒 ；将重组慢病毒感染HeLa细胞，利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆，PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中 的染色体整合状况，RT—PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响。结果 经鉴定，重组慢病毒载体 pLenti6．3／V5一hTERT携带hTERT基因，hTERT基因包装至病毒颗粒。重组慢病毒感染 HeLa细胞后，得到具有杀稻瘟菌素 抗性的细胞克隆，其染色体DNA整合有外源hTERT基因，细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细 胞。结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体，能够提高HeIJa细胞 hTERT基因mRNA的表达量。 [关键词]人端粒酶逆转录酶基因；重组慢病毒；共转染 [中图法分类号]Q784；R318 [文献标志码]A [文章编号]1000-2715(2014)01-0165-05 Constructionand identification ofa recombinantlentiviralexpression vector containinghTERT gene ZhangQingfeng，ZhangFangting，ShenHufiang，GaoShuying (1．DepartmentofBiochemistryandMoleculuarBiology，ZhuhaiCampusofZunyiMedicalUniversity，Zhuhai Guangdong519041，China；2．CentralLaboratory，PekingUniversityShenzhenHospital，ShenzhenGuangdong 518036，China) [Abstract]ObjectiveToconstructarecombinantlentiviralvectorcontaininghumantelomerasereversetran— scriptase(hTERT)gene，andinvestigateitsexpressioninHeLacells．MethodsUsinggatewayreaction，hTERT genefrom thecloningvectorpENTR221一hTERTwasrecombinedintothelentiviralexpressionvectorpLenti6． 3／V5一DEST toconsturctarecombinantlentiviralvectorpLenti6．3／V5一hTERT．Then，therecombinantlenti— viralvectorwasCO—transfectedwithpackagingplasmidspLP1，pLP2 andpLP／VSVG into293FFcellstOpro— ducerecombinantlentiviurs．TheresultingrecombinantlentiviruswasusedtotransduceHeLacells．Positivecell cloneswereselectedusingblasticidin，thechromosomalintegrationofexogenoushTERTgeneweredetectedby PCR，andtheeffectofrecombinantlentiviurst