粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质.pdfVIP

王 亚 ．等：粘质沙雷氏茵马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质 富马酸 (Fumaricacid)，又称反丁烯二酸 、延胡 marcescens来源的马来酸顺反异构酶在大肠杆菌 中 索酸，是一种天然存在的有机酸l1J。作为一种重要的 的高效表达 ，并对重组酶进行 了分离纯化及酶学性 四碳平 台化合物和精细化工产品圜，富马酸广泛用 质等研究。在此基础上 ，研究了马来酸浓度对反应 于食 品、医药 、化工 、涂料 、增塑剂等领域[31。如在食 速度 的影响以及不 同浓度 的马来酸完全转化为富 品方面 ，可用作 口味纯正的酸味剂 、风味增强剂。在 马酸的反应时间，为马来酸顺反异构酶的工业化应 医药方面 ，可 以用于生产解毒药二巯基丁二酸钠 用提供 了实验依据和理论支持 。 等 ．富马酸铁则广泛应用于医学上治疗人体的小红 血球贫血病。工业级富马酸主要用于生产不饱和聚 酯树脂和醇酸树脂，以及用作生产电泳漆。另外，富 1．1 实验材料 马酸可以通过生物转化生产一些具有其他工业用 1．1．1 菌株与质粒 粘质沙雷 氏菌 S．marcescens： 途 的重要化合物原料 ，如 L一天冬氨酸 、L一丙氨酸和 NITE Biological Resource Center (NBRC)； L一苹果酸等 。目前 ，富马酸的生产大都通过石化方 EscherichiacoliBL21(DE3)，质粒载体 pET24a(+)： 法由马来酸酐制备得到，然而化学合成法存在成本 Novagen公司产 品。 高、副产物多及可能造成的环境污染等 问题 ．这使 1．1．2 主要试剂与仪器 肋 DNA聚合酶、各种限 得人们 的 目光逐渐转向环境友好的生物法来制备 制性 内切酶 、T4DNA连接酶等 ： 日本宝生物工程 富马酸l】1。生物转化法多由固定化菌体细胞催化[41， (大连)有 限公司产品；基因组 DNA提取试剂盒 、质 此法会使产物富马酸 (重要的三羧酸循环 中间代谢 粒 DNA提取试剂盒 、胶 回收试剂盒和 PCR产物纯 产物)被菌体本身代谢转化成其他副产物 ，造成转 化试剂盒 ：上海生物工程公司 ；AKTA蛋 白纯化系 化率降低 ，而酶法转化则可 以有效地解决这个问 统 ：通用电气医疗器械集团产 品；HisTrapFFcrude 题 。作者本研究发现 ，马来酸顺反异构酶几乎可 以 镍柱 ：通用电气医疗器械集团产品。 将底物马来酸完全转化为富马酸 。这为生物酶法工 1-1-3 引物设计与合成 根据 Kazuhisa等人8[1关于 业化制备高纯度富马酸提供 了有利的科学依据 。 marcescens马来酸顺反异构酶报道的基因序列设 马来酸顺反异构酶 (EC5．2．1．1，Maleatecis— 计引物。分别在上游引人EcoRI酶切位点和保护碱 transIsomerase．MaiA)是一种能够将马来酸 (顺丁烯 基 ．下游引入 HindllI酶切位点 ．在 C端表达 His标 二酸)催化转化成富马酸 (反丁烯二酸)的异构酶 ， 签 。试验 中所用到 的引物 由上海生物工程公司合 能够在碳碳双键不断裂的情况下，实现顺式丁烯二 成。引物序列为 (划线部分分别为EcoRI和HindIII 酸向反式丁烯二酸 的异构化 ，属于天冬氨酸 、谷氨 限制性内切酶酶切位点)： 酸消旋酶超家族6[1。由于具有催化反应 pH范围宽泛、 Pl：5一CCGGAATTCATGAGCAACCACTACCGC 较低的K 值以及较高平衡常数的特点，马来酸顺 A一3 ： 反异构酶被认为是可用于工业生产富马酸 的有潜 P2：5一CCCAAGCT1；ATAAGCGCCGGACAG一3。 力 的生物催化剂之一_7I。马来酸顺反异构酶广泛存 1．2 实验方法 在于一些可吸收利用马来酸的细菌 中，如假单胞菌 1．2．1 MaiA基 因的克