家蚕丝腺特异高量表达丝氨酸蛋白酶抑制剂与研究.pdfVIP

摘要 家蚕丝腺特异高量表达丝氨酸蛋白酶 抑制剂的研究 特种经济动物饲养硕士研究生：王凌燕 指导教师：赵萍教授 夏庆友教授 摘 要 家蚕丝腺是合成丝蛋白的重要器官，家蚕丝腺中的丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类重要的蛋 白酶抑制剂，有研究报道其可能和家蚕丝蛋白的合成和保护有关。要阐明家蚕丝蛋白高效特 异合成的机理，家蚕丝腺中丝氨酸蛋白酶抑制剂的调控作用是关键问题之一，但目前其相关 研究报道还较少。2003年本实验室成功绘制了家蚕基因组框架图，2006年完成了家蚕全基因 组的寡核苷酸芯片的研制以及从基因水平、表达水平和蛋白质水平建立了功能基因组研究平 台，为我们系统分析家蚕丝腺丝氨酸蛋白酶抑制剂的种类、结构特征和进化关系提供了研究 基础和技术保障。本研究首先利用蛋白质研究方法对家蚕丝腺中的胰蛋白酶抑制剂多态性进 行了调查，然后利用分子生物学和生物信息学方法对家蚕丝腺中的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行 了全基因组数据鉴定，对其中重要的抑制剂基因进行了克隆和原核表达。主要结果如下： 1．家蚕丝腺中丝氨酸蛋白酶抑制剂的多态性调查 对25个家蚕品系丝腺的胰蛋白酶抑制剂的多态性分布进行了调查，电泳图谱分析表明在家蚕 不同品系中所含的1r1种类不同。以家蚕大造为例，我们对同一品系不同组织器官中的TI类型 进行调查发现，11在组织间存在多态性，丝腺中的1r1种类与其它组织含有的11种类不同， 具有特异性。以家蚕品系大造和21．872为例，对不同品系5龄不同发育时期丝腺的T1种类进 行调查发现，品系不同，1r1种类不同；而不同的T1种类其活性检N-N的发育时期不同，但所 有1r1种类的活性都随着发育时期的进行而逐渐增强，吐丝第2天达到最大，后慢慢降低，蛹 第1天时几乎检测不到活性。 2．家蚕茧壳中丝氨酸蛋白酶抑制剂的理化性质初探 西南大学硕十学何论文 利用Native．PAGE和TI活性染色方法，我们对家蚕陈旧茧壳中的1rI活性进行了调查， 发现家蚕陈旧茧壳中的11活性较新鲜茧壳相对降低，个别11种类活性甚至消失。利用不同 pH和温度处理家蚕茧壳发现，T1种类不同，其对酸碱和温度的稳定性不同，其中T1．Ⅵ对pH 和温度最稳定。 3．家蚕丝腺丝氨酸蛋白酶抑制剂的种类、结构特征和进化关系 利用家蚕全基因组数据、基因芯片和EST数据，对家蚕丝腺中的丝氨酸蛋白酶抑制剂进 行了全基因组数据鉴定，在家蚕丝腺中共鉴定了14种丝氨酸蚩白酶抑制剂特异高量表达，分 序中的邻接法对这14种丝氨酸蛋白酶抑制剂与其它物种中的丝氨酸蛋白酶抑制剂构建进化树 发现，相同结构域的抑制剂首先聚在一起，说明家蚕丝腺特异高量表达的这四种结构域的丝 氨酸蛋白酶抑制剂在物种间是比较保守的。 4．家蚕丝腺丝氨酸蛋白酶抑制剂的克隆和原核表达 隆，获得了完整的编码序列。利用大肠杆菌表达系统，表达了BmSPIs6，获得了较纯的BmSPIs6 蛋白样品。 我们希望通过对丝腺特异高量表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究，为了解其在丝腺生长 发育中发挥的重要作用和阐明丝蛋白高效特异合成的机理提供理论数据支持。 关键词：家蚕丝腺丝氨酸蛋白酶抑制剂特异高量表达 ABSTRACT · · · · · ^ r”● o，’‘ 1 · l anCI of 1SSUe—SpeCltlC hlgh-levelexpresslon Silk SerineProteaseInhibitors gland in the m