Canstatin基因表达载体的构建与其生物学效应研究.pdfVIP

大会交流 主生匿堂金箜盔达垒国璺匹瘟堂垄金这 ·肺癌·纤支镜·胸膜疾病· 27．Canstaftn基因表达载体的构建及其生物学效应研究 第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所(重庆，400037) 李玉英钱桂生黄桂君王兴友余时沧李淑平陈维中戢福云 通过阻止肿瘤血管生成来抑制生长的疗法被称之为休眠疗法。目前，已有多种血管生成抑制剂被 用于这一领域的研究。Canstatin是又一新近发现的内源性血管生成抑制剂，具有很强的抑制血管生成 的作用…。构建Canstatin的真核表达载体，研究其对肿瘤细胞和内皮细胞的生物学效应并阐明其作用 机制，将对该蛋白抑制血管生成的特性及抗肿瘤治疗研究提供理论和实验依据。 材料与方法：(1)材料：①人胎肝组织、细胞株、载体及宿主菌：人胎肝组织来自新桥医院妇产科引产胎儿。 X—Blue 清的Ham’s 加入HBS缓冲液中，使终体积至50}d。取30I血DOTAP脂质体加入HBS 70出，室温放置15分钟。将质粒HBS 25一培养瓶中，37。C 5％c02培养8小时，更换有含10％d、牛血清的继续培养48小时后换用含400 t,g／血C418 (A549为500 CAl8维持抗性。 ug／IId)的选择性培养基，约7天后筛选出抗性克隆后扩大培养，并用200惜／lId 同时用空载体#mV-Script转染上述两种细胞为对照(转染方法同上)，并设未转染细胞对照。③转染细胞 Canstatin mRNA的表达检测：将上述筛选出来的第一代阳性细胞分别扩大培养，常规消化收集细胞悬液于离心 管中，800 书进行。用各组细胞cDNA为模板，Pl、P2为引物常规PCR法检测重组载体转染细胞空载体转染细胞及未转 染细胞(A549，HINF弧)Canstatin 分钟，94。C45分钟，72。C45秒，72C2分钟，32 cycle)。④锥虫蓝拒染法细胞记数[3]：上述细胞经o．25％的胰酶消 化，以1×104接种24孔板，锥虫蓝拒染法每天记数3孔细胞，共8天。观测转染后细胞生长状况和细胞活力。 ⑤细胞周期、细胞增殖检测：细胞消化传代后培养48小时再经常规胰酶消化8。0 mol／LPBS gx10分钟，0．01 LsSl00闪烁计数仪)。⑥原位凋亡检测(aVNEL)法将上述细胞以1 x∥接种放有无菌小盖玻片的24孔板中培 养48小时后PBS漂洗4％多聚甲醛固定30分钟，其余步骤按华美公司原位凋亡试剂盒说明书进行，照相并记 数凋亡率。 94—— —皇坐匿堂垒苤盔达全国堡亟煎璺垄金这 大会交流 PCR产 物琼脂糖凝胶电泳，约700 组质粒经双酶切得到的700bo片段，与预期一致。测序结果显示连接方向正确，证实重组载体构建成 功。(2)A549、HUVEC细胞Canstatin A549细胞与空载体对照组无差别。细胞生长曲线A549细胞干预组、空载体组、重组载体组在细胞倍增 与空载体组及HUVEC细胞未干预组相比倍增时间明显延长、最大增殖倍数、饱和密度显著降低(P 无明显变化，各组均有少量细胞凋亡，但凋亡率o．3％，在正常培养细胞凋亡率正常范围内。HUVEC 细胞重组载体转染后细胞生长周期受到阻滞，Go—G，期细胞增多，G2一M期及s期细胞明显减少，在岛／ 下观察HUVEC细胞重组载体转染组