地高辛标记的核酸探针检测猪伪狂犬病毒野毒感染研究.pdfVIP

第三届猪病防控学术研讨会会议论文集 机会。近30年来，养猪管理的模式发生了较大变化，出现了大规模的集中圈养和母猪集中产房产仔 的模式，这为野毒的保存和在猪群中的传播创造了一个适宜条件。因此对于规模化猪场要确实做好 PRV的监测和防疫。 参考文献(略) 地高辛标记的核酸探针检测猪伪狂犬病毒野毒感染的研究 刘志杰任慧英吖温建新刘文华邹玲韩先杰 (青岛农业大学动物科技学院，青岛266109) 18一T—gE中扩增回收约304bp大小 摘要利用PCR技术从带有伪狂犬病毒(PRV)gE基因的重组质粒pMD 的片段，并制备出地高辛标记的gE基因核酸探针．特异性检测结果表明，该探针能与重组质粒DNA发生特异性杂 PRV野毒的最低栓出量为4pg。应用该探针对ll份繁殖障碍病料进行了杂交检测，共检出4份阳性病料，该结果与 PCR检测结果一致，表明该核酸探针可用于猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断． 关键词伪狂犬病毒、gE基因。地高辛标记探针．斑点杂交、野毒株 种家畜、家禽及野生动物的一种以发热、奇痒(猪一般除外)、呼吸和神经系统疾病为特征的重要 性。猪为重要的病毒贮存宿主和传染源。目前伪狂犬病给养殖业造所成的经济损失是相当大的，仅 次于口蹄疫，我国近年来引进种猪数量逐渐增多，猪伪狂犬病发病率也随之上升，目前湖北、广东 等24个省市都有报道，消灭PRV病已迫在眉睫。目前商业化基因缺失疫苗普遍缺失了gE基因，甚至 立法规定只允许gE(gI)基因缺失疫苗使用。随着基因缺失疫苗特别是gE基因缺失疫苗的广泛使用， 迫切需要一种有效的检测野毒并能检测潜伏感染的诊断方法与之配套。本文报导了制备伪狂犬病病 毒gE基因核酸探针并用其检测猪伪狂犬病毒野毒感染的研究。 1材料与方法 1．1病毒、质粒和疫苗 株gE基因的重组质粒p旧18一T—gE由青岛农业大学兽医微生物学研究室构建并保存；PRV Bartha-k61株疫苗购自青岛易邦生物工程有限公司。 1．2主要试剂 Taq Invitrogen公司：Dig标记及检测试剂盒购于德国B．M公司。 13引物 ACGATGAceTCA 根据发表的PRVgE基因序列，利用Primer5．0设计一对引物：PS5’--ACG ACGG一3’，PR5’一AGGTAGTCGCCGATG CCC--3’。引物扩增长度304bp，由济南赛百盛生物工 程公司合成。 1．4病科采集与处理 基金项目：本研究得到青岛市科技攻关项目(05．INS-45)资助． ‘通讯作者：任慧英。E-mail：renren0228@sina．com 作者简介：刘志杰(1981~)，男，山东青岛人，硕士研究生，主要从事预防兽医学研究． 病毒病 从莱阳、荣成等地采集繁殖障碍病料ll份，主要包括流产胎儿，死胎，弱仔等。采集下列组织： 扁桃体，脾脏，肝脏。所采病料经组织研磨器充分研磨后混合，按l：5用TEN(0．Olmol／LTris．HCI EDTA，0．Imol／L (pH7．5)，0．001moi／L NaCI)缓冲液悬浮收集于离心管内，·70℃反复冻融3次， 7000r／min离。L,5min。取上清备用。 1．5 DNA的提取 疫苗DNA、重组质粒DNA、病料DNA的提取均按照Trizol试剂盒说明书进行。 1．6核酸探针的制备 以提取的重组质粒pMDl8一T—gE DNA为模板进行PCR扩增，预期探针扩增长度茭j304bp。反应 总体系25 pJ，‘lNTP2ttl，DMS02．5 111．分别加入10XPCRbuffer2．5 m，上、下游引物各O．5山，模 2．5 DNA聚合酶0．3 板DNA0I，Taq III，灭菌水14．2山。短暂离心后置于PCR仪中扩增。扩增条件为： rain，5