犊牛精原干细胞的分离制备、冷冻保存与体外培养的研究.pdfVIP

犊牛精原千细胞的分离制备、冷冻保存和体外培养的研究 李万华，吕中华，黄治军，李东旭，郑鹏，胡鹏飞，张贵学。 东北农业大学动物科技学院．哈尔滨．中国150030 摘要以新生牛睾丸为实验材料，对精原干细胞进行分离纯化，体外培养和长期保存。结果表明：牛睾丸组织采用”o．1％胶原酶 Ⅳ+0．1 5％透明质酸酶／0．25％胰蛋白酶n和”消化液I+消化液II“两步酶消化法，两种方法均获得了较高的细胞活率。删sO， 0％DMsO和10{}IEG冷冻液 EG两种冷冻剂的最高细胞复苏率分别为88．78％、85．11％，喇sO的冻存效果优于EG，适宜浓度为lO{I．1 O％EG和蔗糖均可 添加蔗糖冻存后复苏率分别提高0．78％，2．78％，但前者没有提高细胞复苏率，后者提高了细胞复苏率，10％DMsO、1 用作牛精原干细胞的冷冻剂。冻存复苏后培养的精原干细胞的数量变化规律、细胞团的数量和大小的变化情况与新分离后培养 的精原干细胞基本相似，复苏后培养的精原干细胞可以长期生长，并形成集落。 关键词牛，精原干细胞，体外培养，冷冻保存 精原干细胞技术的发展和应用，将会为克隆动物、濒危动物保种、转基因动物的生产、治疗雄性不育及一些人类 遗传疾病的基因治疗提供新的机遇与途径。在我国，一些实验室对小鼠、山羊、猪、鸡的精原干细胞进行了相关的研 究，而对牛精原干细胞的研究很少报道。因此，本研究以新生牛作为实验动物，对睾丸精原干细胞进行分离纯化，体 外培养和冷冻保存，以期为牛精原干细胞移植和体外诱导分化研究奠定基础。 l材料和方法 1．1实验材料 胺，胰蛋白酶，透明质酸酶，胶原酶Ⅳ，DMSO，EG，G，EDTA．Na，蔗糖。 1．2实验方法’ 1．2．1精原干细胞的消化和分离 体积O．1％胶原酶Ⅳ，吹打均匀，37℃水浴消化30mm，反复吹打，DMEM洗3次，离心弃上清。用0．15％透明质酸酶 ／o．25％胰蛋白酶消化15min，终止消化。先后用75-Jm和6lpm孔径的滤网过滤，离心弃上清，用2mlDMEM重悬， 制成单细胞悬液。 l DNA酶I)+消 l DNA酶I)两步酶消化法，与方法A基本相同，区 化液II(20mlDMEM+20mg胶原酶Ⅳ+20mg透明质酸酶+50u 别是消化液I消化60min，消化液II消化30min。 采用Percoll不连续密度梯度分离纯化精原干细胞．收集3带细胞。 l。2．3精原干细胞的冷冻保存及复苏 x 单细胞的冷冻保存：将冷冻液缓慢加入到收集有单细胞的10mI冷冻管中，细胞浓度为I107个／mI，4℃平衡 胞分散均匀。台盼蓝染色、计算细胞复苏率。 分离纯化精原干细胞，将细胞密度调整为2．5x 一次，并更换一次培养液。 曲细精管的冷冻保存：剪碎睾丸组织，加入5ml 管，采用阶段性降温冷冻保存。解冻复苏后，将曲细精管悬液离心，PBS洗涤曲细精管2次，消化(消化方法同1．2．1)， 台盼蓝染色检测细胞复苏率。 睾丸组织块的冷冻保存：剪下lO～20mg的睾丸组织块，将组织块移入预先加有12～15倍体积 冷冻液中冷冻保存。复苏后消化(消化方法同1．2．1)组织块，台盼蓝染色检测细胞复苏率。 1．3．4统计分析 统计分析使用SPSS13．0软件T检验和方差分析LSD法进行显著性检验。 ·：研究由黑龙江省教育厅科学基金资助(项F1编号：105310值)． 作者简介：李万华(1983．)．男，黑龙江人，在读研究牛。研究的方向：动物配子与胚胎工程 ”：通讯作者，E．嫩il：Gx凼aIlg@neau．cdu．c玛Fax：045l一5519t372 328． 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十四届学术研讨会论文集 2实验结果 2．1两种方法对睾丸细胞酶消化的效果 表3．1两同