荷斯坦奶牛X染色体荧光原位杂交探针制备研究.pdfVIP

r1-围笛牧兽医学会动物繁殖学分会第十叫崩学术研讨会论文集 荷斯坦奶牛X染色体荧光原位杂交探针的制备研究 庄新杰，陆阳清，路毅，徐凯，张明’，卢克焕 广西大学动物繁殖研究所，广西业热带生物资源保护利用重点实验室，广西南宁530005 摘要【目的l制备荷斯坦奶牛x染色体特异性荧光原位杂交探针，以期建立一种独立评估分离精子纯度的手段和进一步完善牛 早期胚胎的性别鉴定技术。【方法l采用显微操作仪显微分离奶牛的x染色体，应用DOP—PCR(degenerate 位杂交。【结果】DOP—PcR扩增的片段大小主要集中在200—l x染色体探针与其中期染色体杂交，x染色体有明显的杂交信号。这说明采用显微操作仪分离的x染色体能有效的制备牛x染色 体特异性荧光原位杂交探针，并且所制备的探针也具有特异性。【结论】本试验首次利用显微操作仪成功分离了荷斯坦奶牛的X 染色体，并且制备了具有检测有效性的牛x染色体荧光原位杂交探针，该方法的成功建立为进一步完善牛早期胚胎的性别鉴定 技术和独立评估牛分离精子的纯度奠定了基础。 关奠词牛，性染色体，显微分离，探针，荧光原位杂交 染色体显微分离和微克隆技术是指显微镜下把特定的染色体或染色体片段从分裂相中分离出来，运用聚合酶 克隆最常用的方法之一。随后，该技术在人类和动植物遗传学研究中获得了广泛的应用。在植物染色体显微分离和 微克隆方面发展很快，大部分常用植物的染色体相继进行了显微分离、文库构建和特异性序列的克隆与定位，而大型 哺乳动物的研究却少有报道。利用显微操作仪显微分离牛的性染色体并进行克隆的研究未见相关报道。本试验首次 别进行荧光标记以制备双色x染色体荧光原位杂交探针：标记后的探针与牛中期染色体进行荧光原位杂交以检测 其特异性，以便进一步运用该探针评估牛分离精子纯度和进一步完善牛早期胚胎性别鉴定技术打下基础。 1试验材料 1．1血液样品本研究采集的荷斯坦奶牛血液，由广西大学奶牛场提供。 DNA聚合酶和DNALadder K)：购自德国MERCK公司。Taq CY3．dUTP购自美国Si舯a-Al荫ch公司。其它试剂均为国产普通分析纯。 2方法 2．1荷斯坦奶牛中期染色体标本的制备和X染色体的显微分离尾根静脉取血，经肝素钠抗凝，lh内带回实验室。将 h， 经抗凝的全血O．3．0．5蹦注入预温的淋巴细胞培养液的小瓶中(5IIll培养液／瓶)，于37℃，C02培养箱中培养72 ml。培养的细胞经低渗、离心和C踟0y固定液(甲醇：冰乙酸=3： 终止培养前的66．68h，加入秋水仙素(10u咖1)O．1 保存备用。注意整个过程需在无菌室内操作，所用的水皆为灭菌后的双蒸水，以防止外源DNA的污染。 在改装的显微操作仪目镜下找到事先标记的染色体分散较好的视野，用预先制备的0．2-0．4lJm的微玻璃管 借助显微操作仪轻轻的刮取目标染色体。然后，轻轻的升起沾有目标染色体的微玻璃管，将刮取的染色体连同玻 璃管一同折断于PcR管中。注意整个过程需无菌操作。最后，将含有染色体的PCR管于13000rpm瞬时离心， ．20℃保存备用。 ’ 2．2荷斯坦奶牛X染色体的Dol’呷僳扩增将含有X染色体的离心管中加入蛋白酶K(50pg／mL)O．5pL于37℃ 保温30mm，后于96℃的热水中保温10m血，以灭活蛋白酶K。第一轮的PCR反应体系为模板混合液5uL、lOx Bu虢r 2．5 L。 2．5lj IJ L加水至总体积25lJ L、引物(25pmo¨UuL、dNTPs(10pmo脚L)2．OpL、Taq酶(5U～L)O．5 基金项目：省部共建困家重点实验审培育基地开放课题基金(SB0403)：广西科学研究与技术开发项目课题(桂科转0626001．3．1) 作者简介：序新杰(19引．)，男，山东省临沂人，博士研究牛：研究方向：动物繁殖新技术和动物生殖生理。 ‘通讯作者：张明(1959一)，女，教授，博上生导师；E·mail：