联合SSCP和异源双链分析检测70例DLBCL中BCL-6基因突变的初步分析.pdfVIP

向子宫肌层内侵入而生长引起的是一种细胞增殖性疾病。 AM病变中的异常表达，可能与AM的月经血过多有关，这为临床寻找治疗AM的药物提供了新的思想，通 过选择抑制细胞增殖和使用血管内皮抑制剂以减少AM的发病率。 淋巴、造血系统病理学 联合SSCP和异源双链分析检测70例DLBCL中BCL-6 基因突变的初步分析 浙江大学医学院(310058)赵菁周 韧 弥漫大B淋巴瘤(DLBCL)的遗传学异常是非常常见的，大多数病例发生免疫球蛋白重链和轻链基 因重排，免疫球蛋白重链可变区发生点突变。近年来研究发现癌基因也可发生类似的点突变，女nBCL．6基 因的第一内显子(第一个非编码外显子下游100bp)存在点突变。这一现象与免疫球蛋白重链基因超突变 现象相似，不过突变频率低与免疫球蛋白重链。 BCL．6基因表达的蛋白是一种转录抑制因子，能调控多种重要基因，包括：B细胞分化过程中的 D2。因此，BCL6基因突变积 cyclin blimp．1，IP．10等重要基因和细胞周期调控基因C．myc，p27KIPl，and 累可能导致DLBCL)]中瘤细胞发生异常生存、增殖、基因不稳定性和分化障碍等一系列后果。 目前用于检测基因突变较为常用的的检测技术主要有：单链构象多态性分析(SSCP)、限制性酶切 片段长度多态性(CFLP)、DNA测序、变性的高效液相色谱检测(DHPLC)。 由于SSCP操作简单、敏感，是最常用的突变检测方法之一。PCR产物经过变性产生单链，根据序列 特点发生折叠。在垂直电泳中，由于碱基的改变其空间构象发生变化，电泳迁移的速度也随之改变，通 过电泳条带的迁移表现出来。而异源双链分析(HA)是利用突变序列和野生序列形成异源双链。因为异 源双链的迁移速度比相应的同源双链要慢，单个碱基的错配即可被聚丙烯酰胺电泳检测出来。 为此，本文利用三种突变分析技术对DLBCL的石蜡包埋组织标本70例，用TouchdownPCR扩增BCL6 的主要突变区，同时运用单链构象多态性分析和异源双链分析初步筛选突变，之后直接测序，以期评价 三种方法，寻求最佳的初筛突变方法，并且分析BCL．6点突变的特点。 材料与方法 一、材料 lam连续切片，HE染色，光镜形态学 照为RAJI细胞。所有标本均经中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4．5 观察，诊断标准根据2008版WHO关于淋巴及造血系统肿瘤分类。 二、方法 1．DNA抽提 ·114· la (1)选取代表性蜡块，5m厚切片10张，收于1．5 充分振荡，70。C水浴30 000 mill，再次充分振荡。离心4℃13rpm15rain，弃上清，共3遍。(3)在已脱蜡的 ul 20u min， 组织切片管内加入1000TET溶液十PKl，约56℃水浴过夜。(4)组织完全裂解后95℃加热10 IX u 灭活蛋白酶K，离一LM0000转10一15分钟上清为DNA，取100I。(5)将50l粗提DNAJJN样，电泳割胶回收 纯化DNA。紫外分光光度计测吸光度(A)值后于．20℃冻存。 2．BCL6第一外显子扩增 突变主要发生在BCL．6基因的第一外显子的5’端调控区，本研究选择其中的突变热点：E．10、E．11 司合成。 表1 PCRMIX10 u PCR反应体系采用LEIFENG公司PCRMIX体系gpl，每种引物(25mol／L)|ll，模板 DNAlul，反应体积20u