小鼠乳汁中重组人乳铁蛋白的提取和抗菌活性的研究.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（Ｓｕｐｐｌ．） １９ 小鼠乳汁中重组人乳铁蛋白的提取 与抗菌活性的研究 缪明星　柏亚军　安礼友　周咏松　郭　磊　袁玉国　成　勇 （扬州大学兽医学院　扬州　２２５００９） 摘要　从人乳铁蛋白（ｈＬＦ）ｃＤＮＡ转基因小鼠乳汁中提取重组人乳铁蛋白（ｒｈＬＦ），并用提取的 ｒｈＬＦ进行抗菌活性分析。收集了２个基因和２个品系的（ＰＣＬ２５和ＡＰ基因）转基因小鼠乳汁，采 用凝胶过滤层析法从转基因小鼠乳汗中提取ｒｈＬＦ，提取物通过ＳＤＳＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析，ＥＬＩＳＡ检测提取物中ｒｈＬＦ含量；。按不同浓度ｒｈＬＦ作琼脂扩散抑制大肠杆菌、沙门氏菌试 验。结果表明，通过凝胶过滤层析获得的ＰＣｌ和ＡＰ转基因小鼠乳汁中的ｒｈＬＦ分子量为７８ｋＤａ， ２５ 与天然人乳铁蛋白一致，ｒｈＬＦ对大肠杆菌、沙门氏菌均具有明显的抑菌作用。 关键词　人乳铁蛋白　转基因小鼠　抑菌作用 　　人乳铁蛋白（ｈｕｍａｎｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ，ｈＬＦ）是存在于哺 本实验在已经获得人乳铁蛋白转基因小鼠的基础上， 乳动物外分泌液中的一种铁离子结合蛋白，结构与转 采用凝胶过滤层析法从转基因小鼠乳汁中提取重组人 铁蛋白相似，但铁结合能力是转铁蛋白的２６０倍。ｈＬＦ 乳铁蛋白（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ，ｒｈＬＦ）并进行 是由６８９个氨基酸组成的单一多肽链，分子质量约为 抗菌活性分析。 ７８～９０ｋＤａ。ｈＬＦ具有许多独特的生物学功能，如广谱 ［１］ ［２］ １　材料与方法 的抗菌性 、抗病毒 、增强铁的传递与吸收、宿主防 ［３］ １．１　材料与试剂 御和免疫调节功能、抗肿瘤生长和转移作用 、影响自 由基的生成等。因此，ｈＬＦ作为功能性成分用于食品、 　　ＣＸＧ１型电脑恒温层析柜，ＨＤ３型紫外检测仪， 医药等行业中具有广阔的应用和开发前景。 ＢＳＺ１００型自动部分收集器，ＨＤＡ型层析谱电脑采集 　　乳铁蛋白是富含在初乳中的一种功能因子，它最 分析仪，ＨＬ２型恒流泵（均为上海青浦沪西分析仪器 初于 １９３９年由Ｓｏｒｅｎｓｅｎ等在动物乳中发现，１９５３年 厂生产）；ＰｏｗｅｒＰＡＣ３００垂直电泳系统（美国ＢｉｏＲａｄ Ｐｏｌｉｓ等在制备乳过氧化物酶时得到了它的粗制品， 公司），酶标仪 Ｅｌｘ８００（美国ＢｉｏＴＥＫ公司）。层析柱 １９６０年Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ和Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ等从人乳中首次分离出 （６０ｃｍ×１．６ｃｍ），填料为 ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ［４］ ，透析袋（透析分子量为１４ｋＤａ～１００ｋＤａ）。 ＬＦ 。人们试着采用离子交换层析、凝胶过滤层析、亲 和层析、色谱、超滤等各种方法从乳中分离ｈＬＦ，由此获 　　ＰＣＬ、ＡＰ转基因小鼠（本实验室制备），人初乳 ２５ 得的均为天然人乳铁蛋白。而利用动物乳腺生物反应 ５ｍｌ（扬州妇幼保健医院提供）；鸡源大肠杆菌、肠炎沙 器生产的人乳铁蛋白为重组人乳铁蛋白，尽管已有较 门氏菌（扬州大学传染病国家重点实验室提供）；人乳 多人乳中表达人乳铁蛋白的研究报道，但对小鼠乳腺 铁蛋白标准品（Ｓｉｇｍａ公司），蛋白分子量标准（上海生 中表达的重组人乳铁蛋白生物学活性方面的报道很 工生物工程技术服务有限公司）；ＳＤＳＰＡＧＥ试剂（电泳 少， 级），兔抗ｈＬＦ抗