免疫介导运动神经元损伤模型中血清与脑脊液氨基酸测定.pdfVIP

中文摘要 免疫介导的运动神经元损伤模型中血清和脑脊液 氨基酸的测定 摘 要 lateral sclerosis， 目的：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic ALS)是一种选择性累及上、下运动神经元的进行性神经系 统变性疾病，临床表现为肌无力、肌萎缩，多在首次出现症 状后3—5年内死亡。目前该病的病因和发病机制尚不清楚， 其发病机制有多种假说，如：兴奋毒作用、自身免疫异常、 氧化应激、神经丝异常、神经元凋亡以及线粒体功能障碍等。 许多证据表明谷氨酸介导的兴奋毒性作用是ALS发病的重 要环节。谷氨酸是中枢神经系统内重要的兴奋性神经递质， 谷氨酸能神经元过度激活及突触间隙中的谷氨酸过多堆积 均可通过激活谷氨酸受体对突触后神经元及其周围组织造 成兴奋毒性。本试验应用牛脊髓前角灰质匀浆免疫豚鼠建立 免疫介导的运动神经元损伤模型，通过测定模型中免疫组、 正常对照组和免疫对照组间豚鼠血清与脑脊液中谷氨酸、天 冬氨酸、甘氨酸、1fr一氨基丁酸含量来探讨其发病机制。 方法：l免疫介导的运动神经元损伤模型的建立 采用 健康雄性4月龄白化病远交系美国Hartley豚鼠，随机分为 免疫组、免疫对照组和正常对照组。免疫组用牛脊髓前角加 入到PBS和福氏佐剂中做成匀浆，皮下十点注射。首次免 疫应用牛脊髓前角匀浆加完全福氏佐剂，其后每4周应用牛 脊髓前角匀浆加不完全福氏佐剂免疫，共免疫四次。免疫对 照组：将PBS和福氏佐剂做成匀浆免疫豚鼠。正常对照组： 中文摘要 用PBS皮下注射豚鼠。免疫后观察豚鼠肢体活动情况，进 行神经功能评估。每周称体重，每4周做肌电图。当豚鼠出 现肢体无力时停止免疫，当动物不能翻身时取材，从眼内眦 或心脏抽血放入4℃冰箱，静置过夜后离心，抽取上清；从 小脑延髓池抽取脑脊液。血清和脑脊液放入一70℃冰箱保 存。ELISA检测血清中IgG水平。取新鲜股直肌肌肉作肌 活检。用4％多聚甲醛一O．05％戊二醛一0．2％苦味酸固定液 灌注后取脊髓颈、腰膨大后用相同的固定液后固定3天。颈、 腰膨大做脏、甲苯胺蓝染色观察运动神经元数目、神经元 变性情况以及IgG免疫组化染色观察脊髓运动神经元内有 无IgG沉积。 2免疫介导的运动神经元损伤模型中血清和脑脊液氨 基酸含量的测定 应用高效液相色谱分析仪检测正常对照组、免疫对照组 与免疫组豚鼠血清和脑脊液中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、 Y一氨基丁酸含量，结果用均数±标准差来表示。用t检验 分析不同组间四种氨基酸浓度。检验水准0c=O．05。 结果：1成功建立免疫介导的运动神经元损伤模型 免 疫组豚鼠9只出现肢体瘫痪，肌张力减低，体重减低，肌电 图表现为失神经支配，颈、腰膨大示前角灰质运动神经元变 性，数量减少。肌肉活检提示神经源性肌萎缩，ELISA测 定血清IgG水平增高。脊髓免疫组化发现前角运动神经元 内IgG沉积。正常对照组和免疫对照组均未出现上述改变。 2以正常对照组豚鼠血清和脑脊液的四种氨基酸浓度 作为基础值，免疫对照组与正常对照组四种氨基酸均无统计 学差别，免疫组瘫痪豚鼠血清和脑脊液谷氨酸、天冬氨酸升 2 中文摘要 高，甘氨酸、丫一氨基丁酸与正常豚鼠和免疫对照组无统计 学差别，尸O．05。 结论：应用牛脊髓前角灰质匀浆免疫豚鼠，造成豚鼠肢 体瘫痪，脊髓前角运动神经元变性、坏死，神经元数量减少， 从而成功建立了免疫介导的运动神经元损伤模型，通过测定 免疫豚鼠血清和脑脊液中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、Y 一氨基丁酸含量，发现免疫组瘫痪豚鼠血清和脑脊液中谷氨 酸、天冬氨酸增高，对照组不增高，提示氨基酸的兴奋毒作 用可能参与了免疫诱导的运动神经元损伤过程。 关键词：肌萎缩侧索硬化；免疫介导；谷氨酸；高效 液相；豚鼠 in