双重PCR法检测出口冷冻淡水水产品中单核细胞增生性李斯特菌研究.pdfVIP

双重PCR法检测出口冷冻淡水水产品中单核细胞增生性李斯特菌的研究 朱堂明1。郭明星2，郭爱珍1，陈建军2，赵晖2，王振华2，徐家文2，徐新生2张承贤1 【摘要】目的建立一种快速有效地检测出13冷冻淡水水产品中单核细胞增生性李斯特菌(Ln)的方法。方法以李斯特菌属特 异性i印基因和种特异性hly基因为靶序列，建立双重PCR方法；比较和优化i种提取模板的方法；通过干扰实验、模拟污染实验等 板进行扩增。结论建立的双重PCR方法快速、敏感、特异，是一种快速有效检测出口冷冻淡水水产品中单核细胞增生性李斯特菌 fLm)的有效方法。 【关键词】PCR；检测；淡水水产品；单核细胞增生性李斯特菌 1．1．1．2分离菌株试验用的12株分离株(3株来源 单核细胞增生性李斯特菌(1isteriamonocytogenes， Lm)能引起人类脑膜炎、败血症、流产等疾患，死亡率 于冷冻虾仁、4株来源于冻河虾、2株来源于冻煮整肢 高达20％”1，它又可使牛、绵羊、山羊、禽、兔等动物 虾、2株来源于冷冻蛔鱼片)由湖北省出入境检验检 发病，犊牛或羊羔表现为败血症或肝等脏器无限坏死 疫局技术中心采用sN标准方法分离、鉴定为单核细 灶，成年牛羊往往表现为神经症状的“转圈病”，可致 胞增生性李斯特菌。 孕畜流产，带菌的健康动物往往经粪排菌污染环境91。 上世纪80年代初Lm被列为食源性致病菌”1，并认为是 一种分布十分广泛的食源性致病菌”1，上世纪90年代 自上海生工)；EB培养基(胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤， Lm被WHO歹tJ为食品四大致病菌之一15l。我国淡水水生 Extract TrypticaseSoy—Yeast 生物资源丰富，冷冻加工的淡水水产品出口量逐年增 蛋白胨水，BufferedWater)(购自北京陆桥有 Peptone 加。Lm是保证出口冷冻淡水水产品质量安全的必检项 Broth)(购自青岛 限公司)；NB(营养肉汤，Nutrient 目，目前检钡llLm的SN方法需5一l利“。mini—VID等仪器科园海博生物技术有限公司)。 检测方法需要特殊试剂且检测成本高。本研究以Lm种 1．2方法 1．2．1模板的制备 特异性llly基因和李斯特菌属特异性iap基因为靶序列 建立了双重PCR检测方法，并在湖北出口冷冻淡水水 产品检澳IJLm中进行了初步应用。 抽提试剂盒说明书操作，提取Lm基因组。 1材料与方法 1．2．1．2溶菌酶一蛋白酶K法提取按XiaohuiZhou”1、 1．1材料 巢国祥131所发表的文献方法操作，稍作改进，提取DNA 1．1．1茵株 模板。 1．1．1．I标准茵株Lm54005株、英诺李斯特菌1．2．1．3茵体直接作为模板取增菌菌悬液或Lm无 (Listeriainnocua)、绵羊李斯特菌(Listedaivano删、西菌蒸馏水菌悬液直接作为PCR扩增模板。 尔李斯特菌(Zdsteda str．4b seeligeh)、威尔李斯特菌(Listerla1．2．2引物设计参考Listeria monocytogenes welshimen)、格氏李斯特菌(Lasteriagraft)、默氏李斯 特菌(Listeda c必)、 因引物。引物序列如下： rau