戊型肝炎病毒多拷贝分泌表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达.pdfVIP

ChineseJournalofNew Drugs2015，24(3) 戊型肝炎病毒多拷贝分泌表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达 郭 敏 ，雷 清 ，刘 晓 ，蒋 琳 (兰州生物制品研 究所有限责任公司，甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州 730046) [摘要 ] 目的：将胞 内表达载体 pAO815改建成分泌型表达载体 ，并体外构建戊型肝炎病毒 ORF2 。 多拷贝重组表达质粒 ，进一步比较不同转化子在毕赤酵母 中的表达水平，以得到高表达重组菌株。方法 ：利 用重叠PCR技术将 a-factor信号肽基 因与 目的基 因ORF2： 。拼接后插入去磷酸化的pAO815载体 ，得到分 泌型表达重组质粒仅O·RF2：。 。／pAO815(单拷贝)，然后将 BamHI和 BglII双酶切获得的 目的基 因表达盒 (AOX——ORF2128-660)插入到去磷酸化 的重组质粒 仪一ORF2： 。／pAO815中，得到 2(AOX一一ORF2l28-660)／ pA0815(2拷贝)，电转化毕赤酵母 GS115，甲醇诱 导，SDS—PAGE分析不 同拷贝数转化子的表达产量，ELISA 检测表达产物的生物活性。结果 ：o~-factor信号肽基 因与 目的基 因ORF2 。已克隆入表达载体 中，目的蛋 白分泌至诱导液上清中，相对分子质量约为59000，与阴性对照比，单拷 贝、2拷贝转化子表达 的产物均有生 物活性但表达水平无区别。结论 ：成功改建成分泌型表达载体 ，构建 了多拷贝重组表达质粒 ，并且成功表达 了目的蛋 白，为利用改造 的pAO815载体表达其他蛋 白奠定 了基础。 [关键词] 戊型肝炎病毒；重叠 PCR；多拷贝表达盒；毕赤酵母 ；pAO815载体；胞 内表达载体 ；分泌型表 达载体 [中图分类号]R969．4 [文献标志码]A [文章编号]1003—3734(2015)03—0271—06 Constructionofmultiplecopysecreteexpression cassetteforexpression ofhepatitisE virusORF2128 inPichiapastoris - 660 GUOMin，LEIQing，LIUXiao，JIANGLin (LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo．，Ltd．，CenterforGansuProvincialVaccine EngineeringResearch，Lanzhou730046，China) [Abstract] objective：ToreconstructintracellularexpressionvectorpAO815intosecreteexpressionvec— tor，constructmultiplecopyrecombinantexpressionplasmid invitro，and compareexpressionofdifferenttransfor— mantsinPichiapastorisin ordertoobtain high levelsofprotein expression strain．M ethods：Usingoverlapping PCRtechnology，genea扣 ctorsignalpeptidegeneandORF2128—66。weresplicedbeforeinsertionintopAO815EcoR Isite，andBamH I＆ BglIIdigestionwasusedtoobtaintheexpressioncassetteAOX一一ORF2l28 forinterest