荧光引物实时RT-PCR检测禽流感病毒研究.pdfVIP

禽流感 荧光引物实时RT—PCR检测禽流感病毒的研究 黄兵“3 3 梁成珠2t 艾武1 高宏伟2 王莉莉· 朱来华z 王作佳z 陈溥言s (1·山东省家禽研究所禽病研究中心，济南250023}2．青岛检验检疫局，青岛266002 3．南京农业大学，南京210095) [摘要]一种利用单一荧光染料标记引物的实时荧光RT PCR方法被建立起来，用于检测禽流感病毒NP基因。该引物 只能检测到AIV的RNA，未检出NDV、IBV、IBDV和REV等其它RNA病毒的核酸。能够检出的AIV NP基因质粒拷贝数达3．6 ×102 率为100％。从病毒核酸提取到检测结果的整个实验操作仅在4h内即可完成。实验数据表明该方法特异、敏感，可作为当前快速诊 断禽流感病毒的另一种手段。 [关键词] 禽流感病毒；荧光引物}实时；RT--PCR 禽流感的临床症状和病理变化因感染禽的种类、年龄、病程长短、并发感染及感染毒株毒力等不同而表现不 同，且无特征性症状和剖检变化。因此禽流感诊断必须依赖于病原的分离鉴定、血清学和分子生物学技术，包括琼 感性，特异性、确诊时间过长或环境污染等而很难满足进出口贸易中快速、敏感、特异、经济的需求。荧光PCR技 术因敏感、稳定、简便而在分子检测方面得到广泛应用。荧光标记方法很多，如TaqMan探针和分子信标技术，通 过报告基团和淬灭基团双标记从而达到特异性检测的目的，其费用相对较高。最近一种新型的使用单一荧光标记 引物的实时PCR检测系统被确立，该方法在性能和价格上已成为实时荧光PCR检测技术的又一个理想选择。禽 流感病毒血清亚型很多，但核蛋白(NP)基因相对保守，具有型特异性，因此，本次试验参照NP基因序列，设计了 一对能够检测所有AIV的通用型引物，荧光引物实时定量RT--PCR方法。 1材料与方法 1．1材料 i．1．1病毒禽流感病毒(HsN，和H。N 病毒(IBDV){网状内皮增生症病毒(REV)。均由本室保存提供。 1．1．3SPF鸡和鸡胚山东省农业科学院家禽研究所提供。 1．i．4待检样品鸭肉和鸡肉组织，为待出口的抽检样品，由青岛出入境检验检疫局保存提供。 1．1．5试剂一步法RT--PCR反应体系：购自ABI公司；Trizol 剂包括反转录酶(M—MLV—RT)，Taq酶，dNTP等。 1．1．6仪器设备Eppendor[高速离心机；组织捣碎机；Beckman 荧光PCR测定仪；96孔加样板；饲养隔离器等。 1．2方法 为48h，IBDV为胚毒，REV为鸡胚成纤维细胞毒。一20℃保存备用。 1．2．2模板RNA提取取50ul病毒尿囊液，按Trizol提取试剂说明进行。 物为5’一KQPPFIVAC一3’。引物合成及标记由Invitrogen公司完成。 1．2．4常规RT—PCR检测 2弘L，RT—Buffer(5x)4弘L，Rnasin 301— 生垦曼墼簦堡堂垒盘煎堂坌垒蔓±三选兰查翌煎垒堡塞塞 PCR产物用2％琼 脂糖凝胶电泳分析。 1．2．5实时荧光定量RTPCR检测 50 30肛L反应体系组成如下：2×Master反应液15tuL，40×Rnasin0．759L，模板RNAng，正链引物和负链引物 经95℃15s，60℃15s，95C15s分析熔解曲线。反应中设置不同的引物浓度以确定最佳反应条件。 1．2．6特异性分析 1．2．7敏感性分析 1．2．7．1标准曲线分析提取AIV 稀释，进行实时荧光定量PCR，每个释度做4个重复。根据标准曲线计算出质粒拷贝数与CT值的相关性。 个重复。 1．2．8样品检测各取鸭肉和鸡肉组织5克，捣碎，加10mLPBS(O．01mol／L 接种5个鸡胚。 2结果 2．1 常规RT—PCR检测 电泳分析表明，扩增产物仅为一条带，大小为