早期生长反应基因-1在急性胰腺炎大鼠肝损伤机理中作用研究.pdfVIP

2007’国际普通外科论坛暨第十四届全国普外基础与临床进展学术交流大会 早期生长反应基因一1在急性胰腺炎大鼠肝损伤机理中的作用研究 成都军区总医院全军普通外科中心(成都610083) 邹 树 田伏洲 汤礼军 黎冬喧 汪 涛 石 力 崔建峰 重症急性胰腺炎病死率可达25％～40％，炎性 A组：肝细胞十生理盐水100tzl／ml培养液；B 细胞因子“瀑布”样级联反应是导致其高死亡率的主 组：肝细胞+大鼠TNF-a 10ng／ml培养液；C组：肝 要原因之一。研究表明早期生长反应基因-1(early细胞+大鼠TNF_a20ng／ml培养液；D组：预处理 growthresponsegene-1，Egr一1)通过与某些炎性细肝细胞+大鼠TNF_a20ng／ml培养液；其中Ⅳ组 胞因子如TNF-a基因启动子上的特异序列相结合 而导致后者表达增加，因而我们推测Egr-1在急性或生理盐水培养4h。留取上清液用自动生化分析 胰腺炎发病机制中可能具有某种作用。本实验观察 仪测AST及LDH。 了Egr-1在急性胰腺炎大鼠肝组织及原代培养肝细1．5免疫印迹法检测原代培养肝细胞Egr-1蛋白 胞中的表达，并探讨了其可能的信号转导机理，现将 的表达 结果报告如下。 肝细胞如上处理4h后，以常规方法进行肝细胞 核蛋白提取，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，并行 1材料与方法 免疫印迹反应，反应步骤简述如下： 1．1实验材料 雄性SPF级Wistar大鼠，体重Z30～Z509，购抗(兔抗大鼠EGR-1多克隆抗体)工作液，置室温下 自第三军医大学动物中心。牛磺胆酸钠、PD98059、反应1～1．5h，弃一抗工作液，0．01MPBS清洗 Ⅳ型胶原酶购自Sigma公司；兔抗大鼠EGR-1多克5min共3次；②加入1：200稀释的生物素化的二 隆抗体购自Santa 抗工作液，室温下反应1～1．5h，同上清洗；③加入 Cruz公司；大鼠TNF-a、IL-113 1t ELISA试剂盒及TNF-a购自晶美公司；DMEM培200稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素， 养液购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司。室温下反应1～1．5h，同上清洗；④显色：将DAB 1．2大鼠急性胰腺炎诱导及分组 0．01M 6mg加入10mlPBS中，再加入30％H202 24只雄性Wistar大鼠，随机均分为4组，即A、 10tzl，将膜浸入显色液中，于室温轻轻摇动，蛋白带 B、C、D组，分别剖腹逆行胆管内注射生理盐水、 呈棕黄色后加入2mol／L H：SO。终止反应，用 BW)。 0．01M 1％、3％及5％牛磺胆酸钠溶液(O．1ml／1009 PBS漂洗；⑤以凝胶扫描成像系统进行分析， 1．3肝组织Egr-1免疫组化检测 蛋白表达半定量以各组与A组吸光度(A)比值表示。 大鼠造模后3h，3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉 1．6统计学处理 后剪开胸腔，自主动脉分别灌注生理盐水及10％中 统计数据均以孑±s表示，样本的均数比较及相 性福尔马林后取肝组织及胰腺组织。在灌注前穿刺 关分析分别采用SPSS12．0方差分析与双变量相关 右心耳取血，分离血清留待检测AST及LDH。分析，P0．05为差异有统计学意义。 ELISA法