右旋柠烯抑制人白血病k562细胞生长与诱导凋亡作用的研究.pdfVIP

右旋柠烯抑制人自血病k562细胞生长及 诱导凋亡作用的研究 路晴1郭晓铭1刘正娟1王玉川1鸿秉安2 (1．大涟医科大学附属二院，辽宁大连116023．2．国家中医药管理局分子生物学实验室，大连 116027) 氧化、抗炎、利胆溶石等作用。近年发现右旋柠烯具有抗癌活性，对化学致癌物诱导的结肠癌、乳 豫癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌Ⅱ嘲等具霄预防及治疗效果。右旋柠烯馋蠹低毒性的食 用性药物受到普遍的关注。其分子式见图l。 1．材料与方法 i．1材料右旋拧烯购自美国Sigma公司，含量97％，用二甲基亚砜(DMSo)稀释至所需浓度。 单抗，购自福州迈新生物公司。细胞凋亡Hoechst染色试剂盒，购自于碧云天生物技术研究所。 1．2细胞培养自赢病细胞株K562(入慢性粒细胞白血病细胞株)大连中心医院中心实验室惠赠， ℃、5％C02，饱和湿度孵箱中培养。加药均在细胞的对数生长期进行。 · 1．3碘化丙啶(P王)染色法溅定细胞生长曲线碘亿丙啶染色法的原理：Pl为核酸嵌入型染料， 可嵌入双殷螺旋多核萤酸的结构。但是PI不能穿过活细胞的胞膜，故活细胞拒染，PI染色后的细 Digitonin处理蜃，就可以检溅到惑髂缨臆光密度。将对数生长期鲶自痰病缎胞以每孔l×王0。履豹 以 用l小时后，在波长530hm酶标仪检测凋亡细胞光密度，计算融z(实验组的凋亡细胞光密度)， tonin，每箍20ul， 及醣(鬻性对照组盼胬亡细胞先密度)，溅完屠每孔翻入浓度力38mg／ml的Digi 作用30一45分钟詹，再次酶标仪分别检测数值＆(实验组总的细胞光密度)及数值(阴性对照组 总的细胞光密度)，按公式；细胞存活率一(岛～岛。)／(BD--B，。)×100％，计算出细胞存活率，生 长摔镧率=1-细臆存活率，实验重复3次。并根据纲稳存活率以及药物浓度描绘出细胞生长鳗线图。 ．用细胞存活率对剂量对数作图法求出IC50(半数抑制浓度)。 1．4流式细胞术检测细胞凋亡率收集不同药物浓度处理后泼及酾性对照组的囱血病细胞，细 戆密度药l×IOVL，予实验的第2天取缨胞，PBS洗涤两次螽，予旋涡淀均状态，滴入95％的乙醇， ． 使乙醇的浓度为70-75％，固定细胞24小时以上，离心去除乙醇，PBS洗涤2次，37℃水浴30分钟， 仪测定细胞凋亡率。 1．5荧光染色检测细胞凋亡情况离心收集不同药物浓度处理的细胞样品于1．5毫升离心管内， 加入0。5毫舞匿定液，缓缓悬起细胞，圈定10分钟栽更长封闻(可4C过夜)。固定后离心去翻定 液，用PBS洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动数次。最后一次离心后洗去大部分液体保爵约 50ul液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细脆分布均匀。稍晾干，使缁胞贴在载玻片 Hochest 上不易随液体流动。均匀滴上0．5ml 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液 体，徽骧干。漉～滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净盼盖玻片，尽量避免气泡。荧毙髭 微镜捡测细胞的凋亡情况，凋亡细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。 1．6免疫组织化学染色法收集不同浓度药物处理48小时的各组细胞，分别涂片，冷丙酮中固 p53蛋逸表达。 1．7统计学处理．所有实验均至少重复三次，并得到一致结果。结果用平均值±标准差(芟±s) 表示，组内比较进行单因素方差分析。等级资料采用秩和检验。全部采用SPSSIO．0软件分析结果。 PO．05认荛有统计学意义。 2结果 2，1碘化丙啶(PI)染色法测定细胞生长曲线不同浓度的D—L作用后均对k562细胞生长有抑制 作用。D—L对K562细胞的生长抑制作用随着作用浓度的增加而明显增加，莹剂量依赖性(图2)， 增加，星时间依赖性(图2)，24、48、72小时的抑制率之间比较，经方差分析后具有湿著性差异 (F=