从络病学说论治糖尿病肾病理论探讨和实验研究.pdf

中文摘要 从络病学说论治糖尿病肾病的理论探讨与实验研究 摘 要 目的：应用络病学说探讨糖尿病肾病的中医病机，研制出中药通肾络 胶囊，观察其对DN大鼠的肾脏保护作用及对体外培养正常及高糖状态下 大鼠肾小球系膜细胞的增生、细胞周期、细胞因子、分泌产物及凋亡的影 响，探讨其对DN的。肾脏保护作用及相关机制，为络病学说诊治DN提供 实验依据，反证通肾络胶囊组方的科学性，进一步佐证络病学说的科学价 值。 方法： 理沦探讨：在搜集整理历代医家有关论述及当代关于糖尿病’肾病文献 的基础上，依据络病学说探讨DN中医病机，指出气阴两虚是DN的发病 基础，络脉瘀阻、津凝痰聚是DN的主要病理环节，络息成积是DN主要 病理改变。确立”益气养阴，祛瘀化痰、通络消积”的治法，并据此制定 通肾络胶囊组方。 实验研究： 1通肾络胶囊对DN大鼠肾脏保护作用的实验研究：采用单侧肾脏切 除并腹腔注射链脲佐菌素(STz)的方法建立DN大鼠模型。将雄性SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、缬沙坦组、糖适平组、通肾络低、中、 高剂量组。连续灌胃给药8周。于实验前、给药四周、给药八周分别检测 大鼠体重、饮食量、饮水量、24h尿量、空腹血糖、尿微量白蛋白。于末 次给药后留取血液及组织标本检测肌酐清除率、肾脏系数等指标，应用 HE、Masson染色及透射电镜技术观察镜下病理改变。 B 2通肾络胶囊对DN大鼠TGF1、MMP．2、TIMP一2影响的研究：造 模方法同上，雄性SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、缬沙坦组、糖 适平组、通肾络组。应用免疫组化技术检测肾组织中TGF—D】、MMP-2、 TIMP．2的表达，并采用图像采集分析系统进行定量分析。 3通肾络含药血清对体外培养大鼠肾系膜细胞增生抑制实验：sD大鼠 制取含药血清，作用于以MEM为培养基的系膜细胞株(下同)，实验分 中文摘要 O．125％、2．5％、5％、10％、20％不同浓度含药血清(终浓度，下同)， 而大鼠对照血清也分0．125％、2．5％、5％、10％、20％系列浓度，作用24h、 48h，应用氮蓝四唑盐(MTT)方法，测定不同浓度含药血清刺激下，大 鼠肾小球系膜细胞株(下同)的增生抑制情况。 4通肾络含药血清对体外培养大鼠系膜细胞的倍体实验：系膜细胞株 对照大鼠血清组，B1组：5％含药血清组、B2组：5％对照大鼠血清组、 Cl组：10％含药血清组、c2组：lO％对照大鼠血清组，刺激系膜细胞72h 后，应用流式细胞术分析测定。 5通肾络含药血清对体外培养高糖状态下大鼠系膜细胞凋亡的影响： 用6d后，消化收集细胞和固定细胞爬片，分别应用流式细胞术分析和原 位末端标记法(TUNEL法)检测。 6通。肾络含药血清、通肾络DMSO溶液对体外培养高糖状态下大鼠肾 系膜细胞株 系膜细胞TGFD．一mRNA及细胞上清TGF—目．含量的影响： 10％FBs 0一mmol／L) II(1 高糖25mmol／l十ET-1(1×lO—mol／L)，高糖25mm01／l+ANG 条件下培养，同时给予通肾络含药血清、通肾络DMs0溶液、缬沙坦干预， 并设模型组及正常对照组。刺激48h后收集细胞及上清液，提取细胞RNA， 反转录成cDNA，运用荧光定量PcR方法检测；采用双抗体夹心 ABC—ELISA法测定细胞上清TGF．D．含量。 7通肾络含药血清、通肾络DMs0溶液对体外培养高糖状态下大鼠肾 系膜细胞金属蛋白酶及抑制物的影响：分组及处理同方法6，刺激48h后收 集细胞，提取RNA，反转录成cDNA，运用荧光定量PcR方法检测。 8通肾络含药血清及通肾络DMsO溶液对体外培养高糖状态下大鼠 系膜细胞培养上清产物FN、COLⅣ影响：分组及处理同方法6，收集细胞 上清，采用双抗体夹心ABC．ELISA法测定。 结果：