CD4%2bCD25%2bT细胞在慢性乙型肝炎突发机制中的作用研究.pdfVIP

+ + CD4 CD25 T 细胞在慢性乙型肝炎突发机制中的作用研究 邢同京 李兰娟 曹红翠 陈月美 浙江大学医学院附属第一医院，卫生部传染病重点实验室（310003） 研究表明，慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus ，HBV ）感染的自然史表现为肝炎突发（hepatitis flare ）和缓解反复交替发展的过程。自发性活动是慢性 HBV 感染突发的主要原因。但是目前对于 HBV 感染自发活动的机制尚不十分清楚，一般认为是由于免疫系统产生了针对感染肝细胞表面表达 HBV 抗原的特异性CTL 反应所致。 + + CD4 CD25 T 细胞是近年来发现的一种新型调节性T 细胞，在免疫应答负调控机制中发挥重要 + + + + 作用。新近国外学者研究表明：CD4 CD25 T 细胞能够调节病毒特异性的CD4 T 细胞和CD8 T 细 胞应答，而对其在HBV 感染突发机制中的作用尚未见报道。为此，本研究采用流式细胞检测技术对 + + CD4 CD25 T 细胞在HBV 感染患者的数量和功能进行研究，探讨其在慢性HBV 感染突发机制中的 作用。 对象与方法 1．对象 收集慢性HBV 感染者97 例，其中慢性无症状携带者25 例，慢性乙型肝炎27 例，突发患者23 例，严重突发患者22 例。按2000 年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订标 准诊断。肝炎突发定义为谷丙氨酸氨基转移酶（ALT ）200U/L 。严重突发定义为：（1）血清胆红素 3.0mg/ml ，（2 ）凝血酶原活动度（PTA ）60% ，（3 ）ALT200U/L ，具备上述3 条中两条或以上者。 排除近6 个月内应用激素、α干扰素等药物治疗的患者。排除合并其他肝炎标志物及HIV 阳性者。 健康献血者29 例来自浙江省血液中心。 2 ．标本采集与细胞分离 无菌采集肝素抗凝静脉血10ml，常规分离外周血单个核细胞（PBMC ）。应用含10%胎牛血清的 6/ml ，加入24 孔板中，每孔 1 ml，置37℃、5%CO RPMI-1640 培养液重悬，调整细胞浓度为2×10 2 + + 孵箱中培养3 ｈ，轻晃板子，吸除悬浮细胞，PBS 洗2 遍，即为外周血淋巴细胞（PBL ）。CD4 CD25 T 细胞和CD8+ T 细胞采用磁珠分离试剂盒（挪威Dynal 公司）进行分离，按说明书操作。 + + 3 ．CD4 CD25 T 细胞数量检测 取肝素抗凝全血100µl，加入PE-抗CD4 单抗和FITC-抗CD25 单抗各20µ ｌ，室温下孵育30min， + + 流式细胞仪检测CD4 CD25 T 细胞的数量。 4 ．树突状细胞（DC ）培养 DC 细胞培养参考 Romani 等，略作修改。在上述分离的粘附细胞中，加入含有 GM-CSF （1000U/L）IL-4 （500U/L ）的完全RPMI-1640 培养液 1ml，置37℃、5%CO2 孵箱中培养，3 天后 半量换液，第5 天加入rhTNF-α 50ng/ml ，继续培养至7 天，收集细胞备用。 5．HLA-A2型别鉴定 6/ml ），加入FITC 标记的小鼠抗人HLA-A2 抗体2µl ，4 ℃ 避光 取分离获得的PBMC 50µl （2×10 277 45min ，PBS 洗2 次，流式细胞仪进行检测。