U1+小核核糖核酸嵌合体核酶靶向抑制HCV表达的研究.pdfVIP

阳性患者，有很大部分理论上认为，属于基因前C 区变异1896 位及C 启动子1762/1764 突变。HBeAg 生产障碍，所造成HBeAg 阴性的表现。此类病人仍有慢性肝炎活动，甚至免疫激活成为重症肝炎。 本研究从 2005 年度本院肝穿病人中选出 HBeAg 阴性患者 288 例。根据免疫组化显示，分为 HBsAg （+ ）HBcAg （+ ），HBsAg （+ ）HBcAg （- ），HBsAg （- ）HBcAg （- ），三组情况观察肝病理 炎症活动度/纤维化程度及HBV-DNA 滴度。其中单阳性组占18.75%，双阳性组占60.7%，双阴性组 占14.9%。有研究发现胞质HbcAg 阳性表达与小叶病变活动性及汇管区炎症明显相关，HbsAg 与肝 组织病变无关。与本研究基本相符。同时，三者与肝组织炎症、纤维化程度及HBV-DNA 滴度呈正 相关。与文献报道一致。显示，双阳性（54 例）单阳性（175 例）组均有肝组织炎症、纤维化变化。 HBV-DNA 增高，有病毒繁殖；而免疫组化阴性组（41 例），肝组织炎症、纤维化仍存在，HBV-DNA 有不同程度的增高。表明此类病人仍不能排除乙肝病毒的活动，可能为不明原因肝炎的重要病因之一。 U 小核核糖核酸嵌合体核酶靶向抑制HCV 表达的研究 1 1* 2 2 2 2 王美霞 牛俊奇 王峰 田梅梅 金清龙 1 杭州市第六人民医院（310014） 2 吉林大学白求恩医学部第一临床学院 U 小核核糖核酸（U small nuclear RNA ，U snRNA ）是只存在于真核细胞核内的一种小分子 1 1 1 ， 量的RNA ，其生理作用是剪、接细胞核内的RNA 前体，使其成为成熟的RNA 。我们利用U1 在细 胞核内定位的特性，构建出U1-核酶嵌合体，观察其在细胞内外对HCV 基因组的切割活性，以期为 HCV 感染的基因治疗提供一种新的靶向载体。 材料与方法 1．实验材料 包含有野生型人类U1 snRNA 全序列的质粒pBSIISK+U1 、核酶载体pGEM-Rz 以及 包含有HCV 5，非编码区与部分C 区和荧光素酶融合基因的pCMV/T7-NCRC∆-Luc 由美国康州大学 卫生中心遗传与发育生物实验室刘鹏博士惠赠；Huh7 细胞由本室保存。载体pcDNA3.1 （+ ）T/A 克 隆盒购自大连宝泰克公司。FLX800 发光检测仪购自Bio-TEK 公司；pGEM-T 载体、荧光素酶检测 底物购自 Promega 公司；IMDM 、G418、脂质体购自GIBCO 公司。引物合成和测序由宝泰克生物 工程公司完成。 2 ．HCV 特异性U1-Rz 在细胞外对靶基因的切割活性 2.1 U1-Rz 原核表达载体的构建 2.1.1 第一次PCR 反应：将核酶序列设计为引物的一部分，pBSIISK+U1 为模板。引物1 ∶5’-CCG GAT GTG CTG ACC CCT GCC ATT GGT GTC TGA TGA GTC CGT GAGG ACG AAA CGT TTG GGA CTG CAT AAT TTG TGG-3’ （81mer）；引物2 ∶5’-TCTAGAGGATCCGGTTAGCG～3’ （20mer ）。核 酶的序列取代了U1 的第三个茎-环结构。TA 克隆PCR 产物至pGEM-T ，扩增DNA ；将pBSIISK+U1 259 及上述pGEM-T 用限制性内切酶Kpn2I 及XbaI 消化，待消化完全后将反应液在琼脂糖凝胶上电泳 分离。将含 pBSIISK+U 大片段及 pGEM-T 小片段的凝胶分别切出，纯化。以 T DNA 连接酶将 1