堆型艾美耳球虫BJ株核酸疫苗的构建及免疫保护效果研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜寄生虫掌分会第五次代襄大会暨第八次学术研讨会论文集 原虫部分 堆型艾美耳球虫BJ株核酸疫苗的构建及免疫保护效果研究 鲍卫超，刘群· (中国农业大学动物医学院，北京，100094) 建成堆型艾美耳球虫核酸疫苗(P—a—tubulin)。对所构建的核酸疫苗的免疫效果进行研究，分别 设核酸疫苗高(i00ktg)、中(50／．tg)、低(25“g)三个剂量组，地克珠利药物组、活卵囊组、 X 感染对照组和空白对照组，在鸡只7日龄和14El龄分别进行免疫。一周后用1210‘个 Eacervullna BJ株孢子化卵囊进行攻虫，结果表明a—微管蛋白核酸疫苗中剂量(50ug)免疫 只增重效果明显，相对增重率为82．84％，ACl值为164，有中等的抗球虫效果。 关键词：堆型艾美耳球虫；核酸疫苗；免疫保护效果。 球虫病是严重危害养禽业的一种寄生虫病，全球每年因球虫病造成的经济损失可达20亿英 镑。球虫病目前仍主要以药物防治为主，实际生产中人们虽然采取了穿梭用药、轮换用药和联合 用药等多种用药方式，以减缓抗药性的产生，但抗药性虫株的出现仍是防不胜防。此外，残留问 题也是药物预防中不可克服的问题。早在上世纪50年代开展了球虫活苗的研制和应用，70年代 开展了早熟弱毒菌的研制：近20年来借助分子生物学手段研究球虫的功能性抗原，探索研究基因 工程亚单位苗和核酸疫苗。尤其是核酸疫苗以其独特的激发细胞免疫反应的功能而引起关注，成 为对多种疾病疫苗研究的热点。本试验将堆型艾美耳球虫BJ株的保护性抗原基因a一微管蛋白插 入到真核表达载体中，构建成核酸疫苗，并通过实验室应用初步观察其对球虫感染鸡的免疫保护 效果，为其下一步推广及生产应用奠定基础。 1．材料 1．1基因工程菌及载体 pT—n—tubulin为本试验室保存；DH5a购自北京博大泰克生物基因技术有限公司；真核表达 1．2Etene／la BJ株孢子化卵囊 本实验室保存。 1．3地克珠利 x 由本组提供，含量为l％，推荐剂量为110。拌料。 1．4DNA连接酶、EcoRI、Baml-II、ExTaq酶 本实验室采用pGEX一6P-1载体表达的融合蛋白。 1．5 in融合蛋白 pGEX一6P一1一Ⅱ一tubuI 为宝生物工程(大连)有限公司产品。 基金项目：国家自然科学基金 作者简介：鲍卫超(1979一)，硕士，主要从事鸡球虫基因工程苗的研究。·透讯作者 4 3 !望烹垫苎堕兰童墨兰至竺皇兰竺墨兰三!苎堡塞奎皇竺苎：：奎兰查!塑叁笙兰苎 堡皇塑坌 2．方法 2．1真核表达载体P—o—tubuIin的构建 以构建好的T—a—tubulin质粒为模板，设计引物扩增a—tubu]in ORF基因，引物的上游加 上j(ozak序列和Bam／_{j的酶切位点，下游加上6×His标签和EcoRj的酶切位点，引物如下：上 游 ： 5’一TA—GGATCCGCCGCCACCATGcAGGTTCCccGCTGCGTGTT一3’： 下 游 ： ×buffe5ul，dNTPs 4u]，模板pGDI—T—Q—tubu]in 4ul，Bnup 环；最后再延伸lOmin。 用EcoRI和Bamtt pcDNA3．1和n一微管蛋白基因及片段后，4C连接过夜，次日转化￡co]i感受态DH5 a，碱裂解法 提取质粒筛选重组子，酶切鉴定正确的质粒记为P—Q—tubulin，一200保存。 2．2核酸疫苗P一Ⅱ一tubu|In及空载