中国部分地区产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中qnrA基因研究.pdfVIP

二、大会发言 A1．中国部分地区产ESBLs大肠埃希菌和 肺炎克雷伯菌中qnrA基因研究 浙江省杭州师范学院(310041)李兰娟 浙江大学医学院附属第一医院传染科钱英裘云庆徐小微俞云松陈亚岗 氟喹诺酮类药物是一类重要的广谱抗菌药物，广泛使用于临床各类感染的治疗。随着这类药物的广 泛使用。其耐药性逐渐上升。细菌对喹诺酮类抗菌药物耐药的主要机制包括三方面：一是靶位酶改变； 二是细菌细胞膜通透性改变；三是主动外排增强。这三种机制都是由染色体介导的。近年发现了质粒介 导的喹诺酮类抗菌药物耐药新机制，其由qnr基因介导，其作用机制是阻止喹诺酮类药物与靶位点DNA 解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ结合，从而导致药物治疗失败。该基因在太肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中分离率最 高，且常存在于多重耐药菌株中，其中和ESBLs共存从而导致细菌对头孢菌素和喹诺酮类药物同时耐药 最为多见。亚洲、美洲、欧洲等地相继报道了qnr基因的存在，已引起广泛关注。本研究对我国部分地 区临床分离的产ESBLa大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中qnr基因进行筛查，以了解其存在情况及对喹诺酮 类药物耐药的影响。 材料和方法 一、材料 1．临床菌株：本实验室保存的1998—2002年间浙江、新疆、河南、江苏、沈阳、澳门6个地区临 床分离的产ESBLs大肠埃希菌263株和肺炎克雷伯菌99株，其中浙江分离的大肠埃希菌40株和肺炎克 雷伯菌44株；新疆分离的大肠埃希菌42株和肺炎克雷伯菌22株；河南分离的大肠埃希菌59株和肺炎 克雷伯菌3株；江苏分离的大肠埃希菌3l株和肺炎克雷伯菌30株；沈阳分离的大肠埃希菌32株；澳 门分离的大肠埃希菌59株。 2，标准菌株：接合试验受体菌耐叠氮钠大肠埃希菌J53和qnr基因阳性对照株UABl由上海华山医 院抗生素研究所王明贵教授馈赠。 二、方法 列(登录号：070238)设计引物(略)，引物委托上海生物工程技术服务有限公司合成。用煮沸法制备 原始菌、接合菌和克隆菌的DNA作为PCR反应的模板。 2．PCR产物纯化、克隆及序列分析：PCR扩增产物根据上海申能博彩生物科技有限公司提供的纯 化试剂盒说明书进行纯化，取3m纯化产物与pOEM—Teazy载体连接。连接产物转化人大肠埃希菌 插入片段。采用sm日”末端终止法，在ABl377型自动测序仪进行双向测序。结果与基因库颁布的序列 进行比较。 根据NCCLS(美国J临床实验室标准委员会)(2005)公布的稀释法药敏实验判断标准执行。 4．接合试验：供体菌为临床分离的qraA阳性菌株，受体菌为耐叠氮钠的大肠埃希菌J53。在含叠 氮钠(100rag／L)和头孢噻肟(4mg／L)的MH平板上筛选接合子。 24h．限制性内切酶Yd,alI37℃酶切24h。使用CHEF 判断标准：(1)酶切后图谱完全一致者定为同一型如A型；(2)酶切后图谱与A型比较有1—3条带不 B、C、D型等。 结 果 一、PCR扩增结果 菌；2株分离自河南，为大肠埃希菌；1株分离白江苏，为肺炎克雷伯菌。结果见表I。 增片段长度分别为429hp和383bp。(图略) 二、PCR产物克隆测序结果 PaIC均未发生改变。所有测序结果见表2。 表1中国6个地区产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌qnrA基因检测结果 三、接合试验和药敏试验结果 一58— 株该基因均能被同时接合。 表2 13株qnrA阳性菌株ESBLs的基因型和睦诺酮类靶位酶的氢基酸改变 GyrA 菌株CIX—MSHV TEM—— sel83 (；1u84 O一 大肠埃希菌 毋 瞰-¨H 一 № 啪一耻 m