三七抑制人胃黏膜上皮细胞恶性转化作用探析.pdfVIP

2Q坚全国趟出至笪莲螽堂丕盒监童星 大会交流 三七抑制人胃黏膜上皮细胞恶性转化作用研究 北京中医药大学东方医院消化内科(10000))李军祥王志斌 胃癌是人类发生率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，在中国和日本举居各种肿瘤的首位。由于胃癌 的预防还比较困难，因此，加强对胃癌癌前病变的研究和预防就显得尤为重要。目前西医对于胃癌前 病变的逆转治疗尚无特别有效的药物。中医药在治疗胃癌前病变的临床和机理研究很多，但多为复方 研究。我们通过细胞培养方法，从研究灌服三七提取物后的犬血清对胃癌前细胞的抑制作用人手，找 出三七入血后的最佳作用时间点(段)，并进一步研究其促凋亡机理，为开发治疗胃癌的新药奠定基础。 一、实验材料 1．试剂：胰酶：GIBCO公司提供，MTr：SIGMA公司提供，染色液：PI(碘化丙啶)、RNAseA：Sigma 分装，EDTA、甲基亚砜：国产分析纯，其余试剂均为国产分析纯。‘ 410型，酶标仪：Thermo SYSTEM，倒置相 2．仪器：C02培养箱：美国NAPC05 labsystem公司DSX 差显微镜：13本OLYMPUSIM2型。流式细胞分析仪器及软件：FACS 期及凋亡分析软件：ModitLT。 3．细胞：胃癌前细胞系GES一1细胞及MC细胞均由北京市肿瘤研究所遗传室建系并提供。 4．药物：三七提取物，由北京中医药大学中药学院提供。 5．血清药物的制备：用三七水提物给纯种雄性彼格犬一次性灌胃(相当于人体用量的10倍)，取给 rain、120mln、180mln、240min、300rain、360min、480rain、 药前的血清、给药后5rain、10rain、30rain、60 600 min、720min、840min、960rain、1200rain、1440min各时点的血清，灭活补体后于一20℃冰箱冷冻备 用。 二、实验方法 g／L的 1．培养基的配制：基本培养基：DMEM(高糖，GIBCO公司产品)培养基以三蒸水配制，加3．6 牛血清(国产，天津川页公司提供)及青、链酶素各lO万u／L。 min，加入基本培养基，在 2．细胞的消化及传代：0．1％胰酶和0．1％EDTA混合配成消化液，消化1 1000转／min下离心5rain，弃去上清后，打散细胞，重复上步操作，然后分装于新的培养瓶中。当细胞 长到适当密度后，按1：3传代。 3．细胞的冻存：由10％DMSO及90％胎牛血清配成冻存液。冻存细胞浓度约为106个／盯d，吹打后 注入lml塑料冻存管，以封口膜封闭，4℃、一20℃逐级冷冻后，保存于液氮中。 4．Mql『11法检验含药血清对细胞增殖活性的抑制实验：分组：将GES一1及MC细胞对应每个采血时 间点，并根据含药培养基中含药物血清的浓度不同分为8％、4％、2％3组。 步骤：取对数生长期的GE$一1及MC细胞，常规复苏、消化、传代，用完全培养基将细胞稀释至4× lO个／n11，接种于96孔板，每孔加入细胞悬液0．1ml。培养24h，更换含药培养基(含药血清为灭活后 的药物血清与完全培养基按一定比例配制，分为3个剂量：含药物血清终浓度分别8％、4％、2％)，每板 设一行常规培养细胞。然后于72h后吸净培养基，每孔加入MTr(5 ml基本培养 m∥m1)20一，及0．1 min。自动酶标仪540[1ift读取OD 基，继续培养4h。吸去上清，每孔加入DMSO100一，避光振荡10 值。 ． 抑制率=(不加药的对照组平均OD值一给药组平均OD值)／不加药的对照组平均OD值×100％ 并根据对结果的分析，找到最佳的药效时点或时段。 5．流式细胞法检测含药血清促MC