实时荧光RT-PCR快速检测猪瘟病毒的研究和应用+Ⅱ.猪瘟及猪主要繁殖障碍性疾病双重荧光PCR鉴别检测方法的研究.pdfVIP

实时荧光RT=PCR快速检测猪瘟病毒的研究与应用。 Ⅱ。猪瘟及猪主要繁殖障碍性疾病双重 荧光PCR鉴别检测方法的研究 徐璐王琴 范学政 蒋春燕 王泰健孔鹏 宁宜宝 宋 立 (中国兽医药品监察所，北京 100081) 摘要：根据4种引起猪繁殖障碍的病原(猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪细小 病毒，猪伪狂犬病毒)的保守序列，设计了4组特异性的引物和4条探针。将这4种病原体分 为两个反应体系进行检测，初步建立了同时检测这4种病原的双重荧光定量PCR方法。实验 同时，这种方法具有良好的特异性，可以达到快速鉴别诊断的目的。 关键词：荧光PCR，猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪细小病毒，猪伪狂犬病 病毒 SwineFever 猪瘟是由猪瘟病毒(Classical 规定的A类传染病。目前，急性型的猪瘟病例已较少见到，而临床上温和型或称“非典型猪瘟”则逐 渐增多，并主要导致持续感染，胎盘感染、母猪繁殖障碍，死胎、弱胎等症状。猪繁殖与呼吸综合征病 毒(Porcine and Parvovirus， reproductiverespiratorysyndromevirus，PRRSV)，猪细小病毒(Porcine PPV)和猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies 年来随着养猪业集约化养殖规模逐年扩大，这4种引起猪繁殖障碍的病原也呈现了多发、混合感染的情 况，而且呈现非典型化趋势，必须依靠实验室诊断才能确诊。 实时PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监i贝0荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的 量，并据此推断目的基因的初始量。荧光定量PCR在原有的一对特异性引物的基础上又加入了一段高 特异性的探针，因此，与常规PCR相比，它具有特异性更强，敏感性更高，有效解决PCR产物污染等 问题。由于探针标记了荧光信号，所以可以通过电脑分析PCR过程中产生的荧光信号，实现了实时、 器具有同时检测多种荧光的能力，因此，可以在同～检测孔中放人两种或多种探针和引物，达到“一管 多检”的目的。这种优势为上述4种病原的快速鉴别诊断提供了基础。 1 材料与方法 1．1材料 1．1．丑试剂 ·国家自然科学基金资助项目(项目编和国家“十五”攻关子课题(2002BA514A—18—2) ·606· 兽医部分·免疫控制技术 反转录酶(SSⅢ)、Trizol：Invitrogen公司产品 TaqDNA聚合酶、dNTP(10retool／L)、Rnasin：鼎国生物技术有限公司 DNA提取试剂盒：天为时代公司产品 杨汉春教授惠赠；猪伪狂犬病毒闽A株种毒、猪细小病毒种毒、猪瘟石门毒种毒：由中国兽医药品监 察所菌种室提供 1．1．3引物及探针[3~7] 因，PRV的gE基因的保守序列作为靶序列设计探针及引物。 表1实时荧光PCR所用引物和探针的编号 名 称 编号及标记物 上游引物 C一1 下游引物 C一2 CSFV C—T 探 针 (标记基团：5’一FAM；3’一TAM喂A) 上游引物 PS一1 下游引物 PS一2 PRRSV PS—T