动物组织蛋白的提取 - 山西医科大学.docVIP

分子生物学实验讲义 （硕士研究生试用） 山西医科大学 基础医学院 生物化学与分子生物学实验室 2010.6 实验一 动物组织蛋白质的提取 【目的要求】 掌握。 。 【实验原理】 蛋白质种类很多，性质上的差异很大，或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用将细胞内蛋白质提取出来并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。【试剂器材】mM DTT 1mM Triton X-100 1% 去氧胆酸钠 0.5% SDS 0.1% PMSF/异丙醇储备液 100mM（174mg/10ml）于-20℃储存 -20℃储存的冰块 【操作步骤】开，称取g，置于中。剪碎组织，转移到匀浆器中在缓冲液中mL 预冷的裂解缓冲液加，研磨。将研磨液转移到1.5m的离心管中，4℃离心1 4000rpm，10min）。 离心完毕吸取上清液为组织。用考马斯亮蓝蛋白质浓度测定【注意事项】在制备过程中组织。【目的要求】【实验原理】【试剂器材】【操作步骤】 μg /mL） 另取6支试管，编号为0～5，按下表操作 编 号 0 1 2 3 4 5 1号液 2号液 3号液 4号液 5号液 不同浓度蛋白质溶液（mL） － 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.9％NaCl（mL） 0.1 － － － － － 考马斯亮蓝试剂（mL） 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100 混匀各管，室温下静置10分钟，于595 nm处进行比色。 绘制标准曲线：以A 595 nm为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 测定未知样品蛋白质浓度： 测定方法同上，取适量未知样品，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A 595 nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白质的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度。 【注意事项】实验 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 【目的要求】 了解并掌握SDS 2.掌握垂直板电泳的操作方法 【实验原理】 SDS）—聚丙烯酰胺凝胶）电泳可根据分子大小差别分离蛋白质，并可测定蛋白质的相对分子量，与电泳过程中的物理效应有关： 1凝胶的分子筛效应聚丙烯酰胺凝胶是在催化剂的作用下聚合而成的具有网状立体结构的微孔凝胶蛋白质在电场中通过此凝胶时，大分子蛋白质受到的阻力大，，小分子受到的阻力，得以分离。 2电荷效应SDS是表面活性剂，在蛋白加入SDS，能与蛋白质分子上的疏水基团结合，由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，电荷量远远超过蛋白质分子原有的电量，因而掩盖了蛋白质分子的电荷差别，使各种SDS-蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷。 3蛋白质SDS-蛋白质复合物在溶液中因此，蛋白质SDS凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，主要取决于分子量的大小凝胶对样品的浓缩效应SDS使用一种不连续的缓冲系统，即分为低浓度的胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶缓冲液的pH值和离子强度也不相同。电泳时，样品中的SDS-蛋白质复合物体积。SDS凝胶通常被用于蛋白质制品纯度的鉴定和蛋白质分子量测定。 【试剂器材】 1